オレゴン大学の研究ツームが、ユニークな sgRNA スペーサーをコードするマイクロアレイ由来オリゴの大規模なプールを使用することで [Figuer１引用右図 A参照]、スケーラブルで費用対効果の高い sgRNA 合成ワークフローをbioRxivに投稿した。 挿入図Aにあるように、大規模なオリゴ・プールを構成するサブプール・オリゴは、T7 RNAポリメラーゼによるIVTの前に、ゴールデンゲートアセンブリを介して全長dsDNAテンプレートに組み立てられる。RNA-seq分析により、スペーサーの表現に重大な偏りがあることが明らかになった。すなわち、一部のスペーサーは過剰に表現されている一方で、他のスペーサーはまったく存在しない。以前の研究と一致して、この偏りの主な原因は、スペーサーの最初の4ヌクレオチド内のグアニンに富んだ配列、つまりT7プロモーターのすぐ下流にある配列であることが同定された。
研究チームはこの問題に対処するために、すべてのスペーサーの上流にグアニン・テトラマー（5'-GGGG）を導入した。これにより、389 個のスペーサーを含む sgRNA ライブラリで平均 19% 偏りが軽減された。また、5'-GGGGの挿入の効果は、T7 RNAP バイアスに対処するだけでなく、最新のマイクロアレイ由来オリゴは、カラム由来オリゴと比較して、変異率が低く、品質が同等であることを示している。これは、マイクロアレイ・オリゴの忠実度が低いという以前の報告とは対照的で、合成技術の向上を反映している。
11,640 個のユニークなオリゴのプールを発注し、PCR を介してさまざまなサイズの 10 個の sgRNA ライブラリにサブプールすることで、個別のライブラリを注文する場合と比較して最大 72% のコスト削減が実現した。このアプローチを研究チームのIVTワークフローと組み合わせると、特定の形式を必要とする市販のキットが不要になり、ハイスループット研究に必要な大規模sgRNAライブラリーを手頃な価格で利用できるようになる。
ただし、5'-GGGGの挿入によってバイアスを大幅に抑制されるが、単一の 5'G から開始するテンプレートよりも大幅に多くの高分子量 (high-molecular wetight) RNA 副産物を生成することも判明し、このアプローチにも一定の限界があった。
グアニン・テトラマー導入に依存しない2種類のバイアス低減戦略、すなわちエマルジョン内のスペーサーの区画化と DNA 入力および反応量の最適化、もテストした。どちらの方法も、2,626 プレックス sgRNA ライブラリのバイアスを低減したが、その効果はグアニン テトラマーアプローチに及ばなかった。
[出典] "Optimizing in vitro Transcribed CRISPR-Casa Single-Guide RNA Libraries for Improved Uniformity and Affordability" Villegas NK [..] Plesa C. bioRxiv 2025-03-24 (preprint). https://doi.org/10.1101/2025.03.24.644170 [著者所属] U Oregon (Dept Bioengineering, Dept Biology, Institute of Molecular Biolog)
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