CRISPR-Cas9システムはゲノム編集に革命をもたらしたが、まだまだ多重化には課題がある。天然に見られるCRISPRアレイを模して、スペーサとスキャフォールドからなるsgRNAアレイをコードしたDNAの構築、転写、および成熟の過程がその主たる原因である。
sgRNAアレイ内の反復DNA配列は合成と組み立てを複雑にするだけでなく、相同組換えの感受性を高める。これらの反復配列は、RecA依存的またはRecA非依存的な組換えを促進する相同領域を提供し、DNA複製中に、特にラギング鎖上で複製ずれが発生しやすい。このような事象は、sgRNAカセットの欠失、再配置、または損失につながり、最終的には遺伝的不安定性を引き起こす可能性がある。さらに、Casエンドヌクレアーゼ（例：Csy4、Cas6）などの補助的なプロセシング酵素との共発現は、高濃度で細胞毒性効果をもたらす可能性があり、これらの手法の拡張性をさらに制限する。これらの問題は、CRISPR技術の拡張性を制約し、特に代謝フラックスのリダイレクト、大規模ゲノム再編成の実行、遺伝子制御ネットワークのプローブなどの用途において顕著である。
これらの課題を克服するため、韓国の研究チームはsgRNAアレイの個々の要素のインシュレータとして機能する自己切断型リボザイム [J Biol Eng, 2018] であるRiboJを活用し、sgRNAアレイを効率的に処理し、
要素を分離するRiboJ支援型マルチプレックス塩基編集（RiboJ-aided Multiplexed Base Editing: RAMBE）システムを開発した [グラフィカルアブストラクト引用右図の左上参照]。
要素を分離するRiboJ支援型マルチプレックス塩基編集（RiboJ-aided Multiplexed Base Editing: RAMBE）システムを開発した [グラフィカルアブストラクト引用右図の左上参照]。 RAMBEこのシステムは設計通り、単一の転写産物から複数の遺伝子を正確かつ同時に編集することを可能にした。このプラットフォームを基に、多様なリボザイムと改変された非反復sgRNAハンドルを組み込むことで、反復DNA配列の制限を排除する非反復RAMBE（NR-RAMBE）システムを導出した [先の挿入図左下参照]。
研究チームは、これらのシステムの有用性を検証するため、診断および治療の可能性で知られる、よく研究されているプロバイオティクス株である大腸菌Nissle 1917（EcN）をモデルとして選択した。
EcNの遺伝子改変に対する耐性は、より広範な応用において大きな課題となっていたが、RAMBEシステムによって、EcNにおける効率的かつ同時的な複数遺伝子編集が実現し、酪酸生産の増強と酢酸利用の最適化が実現された。さらに、NR-RAMBEシステムは、非反復sgRNAアレイのスケーラブルかつ費用対効果の高い構築を可能にし、多重化塩基編集法の適用範囲を拡大した。
[出典] "RiboJ-Assisted Non-Repeated sgRNA arrays for enhanced CRISPR multiplex genome engineering in Escherichia coli " Woo S-G, Kim SK [..] Lee S-G, Lee D-H. Chem Eng J. 2025-04-07. https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.162336 [著者所属] KRIBB (Synthetic Biology Research Center and the K-Biofoundry), U Science and Technology (韓国), Sungkyunkwan U (Dept Integrative Biotechnology), KAIST (Graduate School of Engineering Biology), U Texas at Austin
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