CRISPR ヌクレアーゼを介した相同性依存修復（HDR）によってゼブラフィッシュゲノムへの外来DNA挿入を実現できるが、正確な編集の生殖細胞系列伝達率は極めて低い。UMass Chan Medical Schoolの研究チームが今回、正確な編集とその伝達率を向上させる条件を特定することを目的として、10 kbを超える長さのシーケンスリードを可能にするPacific Bioscienceプラットフォームを利用して、１分子ロングリードシーケンスを適用し、ゼブラフィッシュ胚における修復イベントを正確に定量化した。
- 5つの異なる遺伝子座にわたってCas9とCas12aの両方を使用して複数種類のHDRテンプレートを比較し、標的ノックインに最適なパラメータを特定した。
- Cas9 ヌクレアーゼと Cas12a ヌクレアーゼは標的挿入に対して同様のパフォーマンスを示した。
- 化学的に修飾されたテンプレートはプラスミドから体内で放出されたテンプレートに優る。
- 正確な編集の頻度は二本鎖切断と挿入された配列の間の距離に依存する。
- 相同テンプレート内の非相同塩基対は、正確な編集率を大幅に低下させる
- 最適化されたパラメータを用いることで、4つの遺伝子座における正確な挿入において、一貫して20%を超える生殖細胞系創始率（foundation rate）が達成された。
[出典] "Identifying optimal conditions for precise knock-in of exogenous DNA into the zebrafish genome" Oikemus S [..] Lawson ND. Development. 2025-06-19. https://doi.org/10.1242/dev.204571 [著者所属] U Massachusetts Chan Medical School
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