CRISPR-Cas9の標的化メカニズムの本質的なシンプルさとプログラム可能性は、プロトタイプの遺伝子編集薬の開発を爆発的に増加させた。しかし、その治療応用には、潜在的なオフターゲット効果という課題が依然として存在している。腫瘍抑制因子やがん遺伝子の誤った編集は、CRISPR療法のメリットを上回るリスクをもたらす。
Cas9遺伝子治療薬の進歩には、CRISPR-Cas9によるオフターゲット結合および切断の基盤となるメカニズムの包括的な理解が不可欠である。標的DNAおよびガイドRNAの大規模ライブラリとハイスループットシーケンシングを組み合わせることで、ミスマッチ耐性の解析が大きく前進するが、現在の技術の感度では、極めて微量のオフターゲット活性の検出は困難である。ロシアの研究チームによるこの総説は、CRISPR-Cas9を介した遺伝子編集におけるオフターゲットに関わる相互作用のメカニズムに焦点を当て、ヌクレオチドのコンテクスト、酵素の濃度、ガイドRNAの構造、RNA-DNAハイブリッドのエネルギー特性など、様々な因子がin vitroおよびin vivoにおけるミスマッチ耐性に及ぼす影響について考察する。また、オフターゲット効果を予測する技術開発における最近の進歩についても簡潔にまとめる。Cas9-sgRNA 複合体の特異的および非特異的活性のアロステリック制御における Cas9 タンパク質構造の役割に特に重点を置く。
[構成]
1. Introduction
2. Molecular mechanisms of the Cas9-sgRNA complex activity
3. Tolerance to mismatches in key regions of the target DNA
3.1. PAM motif
3.2. Seed region
3.3. PAM-distal region
3.4. The central part of the protospacer (RDR area)
4. Insertions/deletions in the RNA-DNA heteroduplex
5. Combinatorial effect of mismatches
6. The influence of sgRNA structure and sequence on Cas9 activity and specificity
7. Conclusions and future perspectives
Table 1. Factors and mechanisms that can positively or negatively impact mismatch tolerance and specificity of Cas9 [右図に引用].[出典] Review "Off-target interactions in the CRISPR-Cas9 Machinery: mechanisms
and outcomes" Kanazhevskaya LY, Zhdanova PV, Chernonosov AA, Koval VV. Biochem Biophys Rep. 2025-07-05. https://doi.org/10.1016/j.bbrep.2025.102134 [著者所属] Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine (ロシア), Novosibirsk State U；参考文献144件を含む13頁。
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