ゲノム・スクリーニングは機能ゲノミクスに不可欠なツールであるが、従来の手法では、特にハイスループット環境において、細胞環境の複雑さを完全に捉えるには不十分であった。光学的プール型スクリーニング（Optical pooled screening：OPS）は、この限界を克服し、CRISPR技術を介したプールされたハイスループットな摂動（perturbation）と、画像ベースのハイコンテントなディープ・フェノタイピングを組み合わせることで、重要な空間的コンテクストを維持することが期待される。Nature Biotechnology 誌に掲載された2つの手法は、OPSの堅牢性を向上させ、コストを削減する重要な機能強化を導入している。Kudoら [＊１] は、T7 RNAポリメラーゼを利用することで、バーコード増幅において細胞に固有の転写機構への依存を回避したPerturbViewを開発した。一方、Guら [＊２] は、コンビナトリアル・オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションによってバーコード検出を向上させるCRISPRmapを発表した。これらの進歩により、OPSのアクセス性と適用性を、より広範な生物学的疑問にまで展開することが可能になった。

　蛍光活性化セルソーティング（FACS）などのバルク読み取りによるプール型スクリーニングの評価では、得られる情報量が限られる。FACSベースのプール型スクリーニングでは、通常、シーケンス後に摂動特異的バーコードと非標的バーコード間の変化率を比較することで、ゲノム変化を持つ細胞数を推定する。バーコード頻度と細胞数の間に線形関係があると仮定すると、この方法は対照群と摂動群間の適応度シフトを集団レベルで比較できるが、生物学的解釈には限界がある。この問題に対しては、FACSに細胞内の構造を検出する機能を融合した"High-speed fluorescence image–enabled cell sorting" [Daniel Schraivogel D et al., Science 2022] によって、細胞形態とタンパク質の局在をハイスループットで取得可能にはなったが、それでも、個々の細胞が属する微小環境の空間情報は取得できなかった。

　近年のシングルセルRNAシーケンシングの発展と、CROP-seqやPerturb-seq [CRISPR関連文献メモ_2016/12/19] といった手法を用いたCRISPRスクリーニングへの拡張により、個々の細胞レベルでの摂動による転写の微細な変化を理解できるようになった。しかし、これらの手法では摂動の空間的要素を評価できなかったが、この問題はOPS [Feldman et al, Cell 2019] の導入によって解決された。OPSでは、画像ベースの表現型解析に続いて、各細胞で発現したsgRNAを光学的in situシーケンシング・バイ・シンセシスによって画像化し、プールされた形式への移行を可能にする [News & Views記事のFig. 1の上段Traditional OPS参照]。OPS研究では、生細胞イメージングや細胞ペインティングといった情報豊富な表現型および機能のリードアウトを用いて、ヒトゲノム全体をカバーするライブラリを用いて遺伝子摂動の機能的影響を研究してきた。

　OPSをより普遍的に適用可能にするために、KudoらとGuらは、これらの課題に対処するOPSプロトコルを進歩させた。KudoらによるPerturbViewと呼ばれるアプローチは、最近開発されたZOMBIEプロトコル [Askary et al., Nat Biotechnol 2020] を採用しており、T7 RNAポリメラーゼを用いて挿入されたガイドのin vitro転写を可能にする [News & Views記事 Fig. 1中段参照]。摂動を媒介するsgRNAの発現には、T7プロモーターに加えて機能的なU6プロモーターも必要であるため、著者らはsgRNAの上流に最適化されたキメラU6/T7プロモーターを設計した。この設計は、摂動効率を損なうことなく、固定サンプルの画像ベース表現型解析後に組み込んだsgRNAを高効率で転写することにより、従来のOPSプロトコルにおける細胞固有の転写機構への依存を排除する。また、このアプローチは、より複雑なスポット・コーリング法から、主に核内のsgRNAクラスターの解析へと移行することで、摂動解析のアクセス性と堅牢性が向上した。

　2つ目の研究では、GuらはCRISPRmapを紹介している。これは、摂動関連バーコードの読み取り法を改良し、in situ sequencing-by-synthesisをオリゴヌクレオチド蛍光in situハイブリダイゼーション法に置き換えたものである [News & Views記事Fig. 1下段参照]。それぞれの摂動は、特定の一対の読み取り配列を有するプライマーとパッドロック・プローブの独自の組み合わせによってコード化される。蛍光in situハイブリダイゼーションに切り替えることで、コストが大幅に削減され、より堅牢で高感度な読み取りが可能になった。さらに、著者らは、RNAmapと呼ばれる手法を用いて、このアプローチが内因性mRNAの検出にも有効であることを実証している。

　PerturbViewとCRISPRmapは、OPSにおける数々の進歩の一部であり、CROP-seq multi [Walton RT et al., bioRxiv 2024]、NIS-seq [crisp_bio 2024-12-28]、Perturb-FISH [crisp_bio 2025-03-19] も含まれる。これらの手法は、シングルセルシーケンスに基づくCRISPRスクリーニングから得られる高次元のリードアウトと相乗的に作用し、複雑な生物学的システムをかつてない解像度で理解するための新たな可能性を切り開く。GuらとKudoらは、それぞれOPSプロトコルにおける異なる課題に取り組んできた。今後、両者のアプローチを組み合わせた研究によって、両者の長所が融合し、より容易なリードアウトと高感度を備えた、より費用対効果の高い手法が実現する可能性がある。

[出典] News & Views "Advances in optical pooled screening to map spatial complexity" Kahnwald M, Mählen M, Oost KC, Liberali P. Nat Biotechnol. 2024-10-07/July 2025 https://doi.org/10.1038/s41587-024-02434-6 [著者所属] Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research (FMI), ETH Zürich - Department of Biosystems Science and Engineering (D-BSSE) 

[出典] "Multiplexed, image-based pooled screens in primary cells and tissues with PerturbView" Kudo T [..] Regev A, Lubeck E. Nat Biotechnol. 2024-10-07/July 2025. https://doi.org/10.1038/s41587-024-02391-0 [著者所属] Genentech Research and Early Development/Genentech (米国), Bioinformatics Department/ProCogia (カナダ)