塩基編集（BE）は、正確な核酸塩基変換を可能にする。しかし、大腸菌ではBE構成要素の高発現がしばしば毒性を示す。慶尚大学校の研究チームが、
sgRNAおよびBE構成要素の発現のためのプロモーター・ターミネーターを用いて、単一または複数の標的部位におけるBEを解析するためのプロトコルを紹介する [グラフィカルアブストラクト引用右図参照]。sgRNA、合成標的、およびBEモジュールの設計とクローニングの手順について説明する。次に、BE モジュールのアセンブリ、大腸菌の形質転換、および塩基エディターとコンポーネントのテストの手順について詳しく説明する。
sgRNAおよびBE構成要素の発現のためのプロモーター・ターミネーターを用いて、単一または複数の標的部位におけるBEを解析するためのプロトコルを紹介する [グラフィカルアブストラクト引用右図参照]。sgRNA、合成標的、およびBEモジュールの設計とクローニングの手順について説明する。次に、BE モジュールのアセンブリ、大腸菌の形質転換、および塩基エディターとコンポーネントのテストの手順について詳しく説明する。 塩基編集（BE）技術は、2016年にシトシンからチミンへのBE（CBE）、2017年にアデニンからグアニンへのBE（ABE）が初めて報告されて以来、同時二塩基変換やその他の種類の塩基変換を可能にする新たなBEツール群が開発された。しかし、Streptococcus pyogenes Cas9ニッカーゼ（SpCas9-D10A（nSpCas9）など）、デアミナーゼ、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤（UGI）などの補助分子といったBE構成要素の高発現は、モデル細菌である大腸菌やその他の細菌種の細胞生存と増殖に悪影響を及ぼすことが報告されている。
例えば、大腸菌の nCas9(D10A)-PmCDA1、nCas9(D10A)、および dCas9-PmCDA1-1×UGI、アグロバクテリウム属およびストレプトマイセス属の dCas9-PmCDA1-1×UGI-LVA.Tag、シュードモナス属の rAPOBEC1-nCas9(D10A)、枯草菌の nCas9(D10A)-PmCDA1 などが挙げられる。
これらの因子の毒性効果を軽減するために、誘導性プロモーターや弱いプロモーターの使用、タンパク質分解タグの追加、触媒的に不活性な Cas9 (dCas9) の利用など、さまざまな戦略が採用されてきた。これらのアプローチを組み合わせることは有益であることが証明されているが、より活性の高いCBE（evoCDA1、APOBEC3A）およびABE（ABE8e、ABE9e）バリアントの新しいバージョン、ならびにデュアルBEは、増強された触媒活性とより広い編集ウィンドウ（編集可能な塩基は通常20 bpのプロトスペーサーまたはガイド配列内）のために毒性を悪化させる可能性がある。
慶尚大学校の研究チームは、細菌に対する塩基エディターの毒性の課題に対処するため、E. coli におけるBE構成要素のin vivo迅速調査（IRI-CCE: in vivo rapid investigation of CRISPR-BE components in Escherichia coli ）と呼ばれるプロトコルを考案した [＊]。このプロトコルでは、最適化されたプロモーター-ターミネーターの組み合わせを使用して、細胞を死滅させることなくBE構成要素の発現を実現し、
目的のプラスミドまたは染色体標的部位でのBE効率を高める [Figure 1引用右図参照]。また、このプロトコルにより、モジュラー・クローニングにおいてクローン化されたバイオパーツの迅速な検証や、sgRNA関連因子の機能的側面の検証も可能になる。さらに、分子生物学やゲノム編集実験におけるプラスミド DNA ベクターのクローニングに日常的に使用されるさまざまな大腸菌株への適用性が実証されています。
目的のプラスミドまたは染色体標的部位でのBE効率を高める [Figure 1引用右図参照]。また、このプロトコルにより、モジュラー・クローニングにおいてクローン化されたバイオパーツの迅速な検証や、sgRNA関連因子の機能的側面の検証も可能になる。さらに、分子生物学やゲノム編集実験におけるプラスミド DNA ベクターのクローニングに日常的に使用されるさまざまな大腸菌株への適用性が実証されています。[関連論文とcrisp_bio記事]
- 2024-03-04 "Cas9 variants expand the targeting scope of base editing systems in bacteria" Shelake RM, Kim J-Y. Nucleus.
- [＊] 2022-03-16 微生物ゲノム編集に向けてCEBとABEの最適化を支援するツールを開発：IRI -CCE
- 2023-01-20 大腸菌におけるアデニンとシトシンの同時変換を実現する改良型二重塩基編集システム'iACEBEs'
[出典] Protocol "Protocol for assessment of CRISPR base editors and their components in Escherichia coli" Shelake RM, Kim J-Y. STAR Protoc. 2025-07-22/09-19. https://doi.org/10.1016/j.xpro.2025.103973 [著者所属] Gyeongsang National University, Nulla Bio Inc.
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