CRISPR/Cas9は革新的な遺伝子操作ツールであるが、操作に成功した細胞を容易かつ効率的に選別するためには、選択マーカーが依然として不可欠である。近年、抗真菌研究においては、内因性カウンターセレクション用のマーカーが注目されており、ヒトの糸状菌病原体であるAspergillus fumigatu のゲノムに複数の遺伝子を部位特異的に組み込むことが可能になっている。しかし、遺伝子カセットは連続的に形質転換する必要があり、複数遺伝子の組み込みは手間と時間がかかる。
オーストリアにギリシャが加わった研究チームは今回、CRISPR/Cas9と複数の内因性カウンター選択マーカーを組み合わせることで、複数の発現カセットの同時組み込みを実現した。
今回、すでに同定されていたマーカーfcyB とcntA に新たにazgA を加えた３つのマーカーを利用した。これらは、それぞれ、
5-フルオロシトシン（5FC）、5-フルオロウリジン（5FU）、および8-アザグアニン（8AG）の取り込みに関与することを利用して [Fig. 1 B 引用右図参照]、A. fumigatus において3つの発現カセットを同時に三重選択的に形質転換し、ゲノムに組み込むことに成功した。
5-フルオロシトシン（5FC）、5-フルオロウリジン（5FU）、および8-アザグアニン（8AG）の取り込みに関与することを利用して [Fig. 1 B 引用右図参照]、A. fumigatus において3つの発現カセットを同時に三重選択的に形質転換し、ゲノムに組み込むことに成功した。 このアプローチに沿って、3つの異なる細胞レポーターに加え、抗真菌薬アゾール耐性の異なる4つの分離株に株特異的な蛍光レポーターを導入し、同一の生育環境における生育パターンを可視化・モニタリングが可能なことが、実証された。
1回の形質転換で複数の遺伝形質を導入可能にしたこのアプローチは、迅速かつ効果的な多重遺伝子組込みの可能性を高め、真菌の遺伝子工学における幅広い用途に柔軟かつ効率的なプラットフォームを提供する。
[出典] "Simultaneous multigene integration in Aspergillus fumigatus using CRISPR/Cas9 and endogenous counter-selectable markers" Sastré-Velásquez LE [..] Gsaller F. J Biol. Eng. 2025-07-28. https://doi.org/10.1186/s13036-025-00539-3 [著者所属] Medical University of Innsbruck (Austria), University of Innsbruck, Health University of Applied Sciences Tyrol/FH Gesundheit Tirol, National and Kapodistrian University of Athens (ギリシャ), Institute of Molecular Biology and Biotechnology
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