江南大学と華東理工大学の研究チームは以前、レンチウイルス形質導入およびレポーター遺伝子技術を利用して、CHO細胞において安定して外来タンパク質を発現されることが可能な部位を同定し’LOC'と命名していた。
このLOC部位は、CHO細胞における組み換えタンパク質産生のホットスポットになるが、CHO-K1ゲノム中のNW_003626341.1の1689番目の非コードRNA領域である [＊]。
このLOC部位は、CHO細胞における組み換えタンパク質産生のホットスポットになるが、CHO-K1ゲノム中のNW_003626341.1の1689番目の非コードRNA領域である [＊]。
研究チームは今回この「ホットスポット」を利用して、CRISPR/Cas9ゲノム編集とBxb1リコンビナーゼ介在カセット交換（Recombinase-Mediated Cassette Exchange: RMCE）を組み合わせた統合プラットフォームを実装し、効率的な「関心のある遺伝子」(Gene Of Interest: GOI) の組み込みと持続的な発現を実現した。
まず、CRISPR/Cas9を介してBxb1 attP部位、EGFPカセット、プロモータートラップをLOC部位に挿入することで、蛍光ランディングパッド（LP）細胞を作製した。次に、LP細胞を60世代連続で継代培養したところ、一貫して蛍光が観察され、LOC部位が安定したEGFP発現を可能にすることが確認された。続いて、Bxb1 attB部位に挟まれたGOIを含むドナーカセットをRMCEを介して容易に交換した。
このプラットフォームによって、ヒト血清アルブミン（HSA）、インターフェロンα-2b（INFα2b）、組換え第VII因子（rFVII）、上皮成長因子受容体に対するモノクローナル抗体（抗EGFR、AE01）、およびトロンボスポンジン1型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ13（ADAMST13）など、12～190 kDaの範囲の治療標的タンパク質のワンステップ挿入と安定な発現が、実現した。
また、このプラットフォームを介して、3週間以内にHSA CHO細胞クローンを効率的に生成し、振盪フラスコバッチ培養条件で220 mg/LのHSA力価を達成した。
こうして、LOC部位を「ホットスポット」として利用するCRISPR/Cas9-Bxb1パイプラインがバイオ医薬品製造のためのCHO細胞株開発を著しく加速することが示された。
[＊] "Discovery of a stable expression hot spot in the genome of Chinese hamster ovary cells using lentivirus-based random integration" Zhou S, Ding X, Yang L, Chen Y, Gong X, Jin J, Li H. Biotechnol Biotechnol Equip. 2019-04-21.
[出典] "Efficient Construction of Recombinant CHO Cells for Stable Expression of Therapeutic Proteins Based on New Hotspot ‘LOC’" Chen Y [..] Jin J, Ding X. Mol Biotechnol. 2025-10-25. https://doi.org/10.1007/s12033-025-01506-5 [所属] Jiangnan University, East China University of Science and Technology
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