合成生物学の発展に伴い、in vivo進化システムは細胞工場の構築を加速するために応用されてきた。華中農業大学の研究チームは今回、Bacillus amyloliquefaciens における単一遺伝子および複数遺伝子の制御を目的とした効率的なin vivo進化システムを開発した。
まず、融合Cas9nタンパク質と活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（AID）を組み込んだCRISPR/Cas9n-AID塩基編集システムを構築し、単一遺伝子編集においてC-to-Tの塩基変換効率が90%と高いことを確認した。
次に、編集可能なリボソーム結合配列（RBS: SD配列）" GGGGGGGG" を持つ進化テンプレート（XP43）を、2つの戦略を用いてin vivo進化用に設計し、RBS変異ライブラリーの次世代シーケンシングから、拡張sgRNA戦略が最適な進化スキームであることを確認した。
その上で、アルカリプロテアーゼ遺伝子（aprE ）を単一の遺伝子標的として、進化プログラムを開始し、AprEの活性が勾配状に変化する一連の変異株を樹立することに成功した。
さらに、ヘム代謝ネットワークのバランスをとるために、複数の主要遺伝子（dhemA、SAM2、hemEHY）を同時に進化させ、最適な変異株（HZHA-C2）は14.02 mg/Lのヘムを生産し、これは対照株より93%高い値であった。
最後に、hemH 遺伝子の過剰発現により、ヘム力価はさらに49%増加した。流加培養法をした結果、最適改変株（HZHA2/pHY-hemH）のヘム力価は64%向上し、32.61 mg/Lに達した。
[出典] "Regulation of Single and Multiple Genes in Bacillus amyloliquefaciens by an Evolution System In Vivo" Jiang C [..] Wei X. ACS Synth Biol. 2025-12-15. https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00480 [所属] Huazhong Agricultural University
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