CRISPR/Cas9 GEは、Cas9ヌクレアーゼが誘導するDNA二本鎖切断（DSB) を修復する細胞内在の相同組換え修復（HDR）機能を介して、iPS細胞において、疾患関連変異を導入または修正することを可能にすることから、遺伝性疾患のモデル化に広く用いられている。しかし、iPS細胞におけるHDR効率は依然として低く、また、標的遺伝子座に大きく左右される。
スタンフォード大学のIoannis Karakikes准教授とMax Delbrück Center for Molecular MedicineのSebastian Diecke主任研究員が率いる研究チームは今回、合理的に設計された複数のssODNドナーを組み合わせることで、ヒトiPS細胞において、遺伝子座やドナーの設計に依存することなく、スカーレスなゲノム編集とHDR効率の向上を実現し、この手法をCRISPR-MiXとして発表した。
- CRISPR-MiX実装にあたって、GFP-BFPレポーターシステムを用いて、相同アームの対称性、CRISPR/Casブロッキング変異、鎖相補性など、HDRの結果に大きく影響する主要なssODNドナーの設計パラメータを特定した。
- CRISPR-MiXを用いて、遺伝性心筋症に関連する5つの遺伝子に病原性変異を導入し、HDRイベントの定量解析を施したところ、標的遺伝子座とssODN設計の双方がHDR効率に強く影響することが明らかになった。
[補足] HDR効率向上について
CRISPR/Cas9 GEは、主として、HDRと非相同末端結合（NHEJ）という2つのDNA修復機構に依存している。HDRは、ノックイン、ノックアウト、または精密な突然変異誘発に適しているが、非効率的なプロセスである。急速に進化するCRISPR/Cas9ゲノム編集分野では、HDRの効率を高めるための多大な努力がなされてきたが、報告されている成功率は依然としてばらつきがあり、比較的低い。
HDRの効率を高める戦略としては、化学的および遺伝学的調節によるNHEJ経路の阻害、温度などの因子の制御、Cas9融合タンパク質の使用、細胞周期への同期などが挙げられる。しかし、これらのアプローチはしばしば細胞の種類や実験条件に依存する。
HDRとNHEJに対する第3のDSB修復経路であるマイクロホモロジー介在末端結合（MMEJ）は、HDRの効率を高めるために利用可能である。MMEJは短い相同配列を利用してDSBを修復するが、最近の研究では、NHEJとMMEJを同時に阻害するとHDRの効率が向上することが実証されています。
HDRの効率を高めるプローチは別にある。相同修復用のドナーテンプレートを合理的に設計することである。研究では、非対称ssODNを用いて修復テンプレート相同領域の長さを調整すると、編集効率にプラスの影響を与えることが示されていている。さらに、PAM配列にサイレント変異を導入して標的部位の再切断を阻害すると、精度と効率が向上する。
これらの工夫にもかかわらず、iPSCにおける効率的なHDRの達成は依然として困難であり、その成功率は細胞の種類、遺伝子座、実験条件によって異なっていた。
[出典] "CRISPR-MiX: A Pooled Single-Stranded Donor Strategy to Enhance HDR Efficiency in Human iPSCs" Baum R [..] Diecke S, Karakikes I. Mol Ther Nucleic Acids. 2026-01-02. https://doi.org/10.1016/j.omtn.2025.102820 [所属] Stanford University (Cardiovascular Institute, Cardiothoracic Surgery, Departments of Medicine) (米国), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (ドイツ), German Centre for Cardiovascular Research - Berlin；グラフィカルアブストラクト
コメント