CRISPRスクリーニングは、基礎生物学から創薬に至るまで、機能ゲノミクスに不可欠なツールとなったが、調節因子の探索、遺伝子変異の解釈、遺伝子相互作用のマッピングに向けては、既存のアプローチの感度とスケーラビリティを向上させることが課題になっている。Memorial Sloan Kettering Cancer Centerの研究チームが今回、これらの限界に対処するための相乗効果を持つ2つの技術をbioRxivプレプリントサーバーから紹介している。
- PORTAL（Perturbation Output via Reporter Transcriptional Activity in Lineages）は、プールされた遺伝子を定量的なRNA表現型へと転換し、発現転写産物における摂動効果をエンコードすることで、細胞系譜または単一細胞レベルの解像度で単一分子測定を可能にする。1つの組み込みベクターに、sgRNA、クローン・バーコード、および2つのPol II転写産物（摂動応答性プロモーターによって駆動されるレポーター転写産物と、ネストされた構成的プロモーターによって駆動されるアイデンティティ転写産物）がコードされる。sgRNAとクローンのバーコードは3' LTRにコードされ、2つの転写産物が摂動と系譜情報を担っている。
- CAPクローニング（Covalently closed Assembly Products）は、細菌の形質転換を回避し、極めて複雑なレンチウイルスライブラリーの構築を可能にし、PORTALを用いた遺伝子相互作用マッピングのためのデュアルsgRNAライブラリを作成するために使用された。sgRNA1、sgRNA2、およびクローンバーコードオリゴのプールがPCRによってつなぎ合わされ、レンチウイルスバックボーンにアセンブルされ、TelNプロテロメラーゼ認識部位を導入するプライマーを用いて増幅された。TelN処理により共有結合で閉じたヘアピン末端が生成され、細菌による形質転換なしでレンチウイルスパッケージングに直接使用できるエキソヌクレアーゼ耐性の直鎖DNA分子が生成される。
これらの進歩を組み合わせることで、4,600万クローン系譜にわたる665,856のペアワイズ摂動を網羅する遺伝子相互作用マップを構築するに至った。これはヒト細胞における最大の網羅的マップであり、フィットネスに依存しない表現型を用いたこのスケールでの初めてのマップであり、ヒト細胞における包括的な遺伝子相互作用マッピングへの道筋を示している。
[出典]
- "Scaling perturbations: beyond genome-scale CRISPR screens" Tang A, Ardy RC, Mendes RE, Norman TM. bioRxiv. 2026-01-17 [preprint]. https://doi.org/10.64898/2026.01.16.699948 [所属] Memorial Sloan Kettering Cancer Center
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