CRISPR-Casシステムの中でもCRISPR-Cas12aは、ゲノム編集やバイオマーカー検出に一際広く利用されている。オクラホマ大学のRakhi Rajan准教授らは以前、ブリッジヘリックス（BH）と呼ばれる保存されたアルギニンリッチヘリックスに二重プロリン置換（K969P/D970P）を導入したFrancisella novicida 由来のCas12aバリアント（FnoCas12a<KD2P>）を開発していた [＃]。今回は、コンビナトリアルアプローチを用いて、BHを介したCas12aのDNA切断活性化の分子機構の解明を試みた。
異なるコンフォメーション活性化状態にあるFnoCas12aKD2Pの5つの構造を、クライオ電顕法で再構成した [＊：構造情報の項参照]。変異体と野生型（FnoCas12aWT）の構造比較、活性アッセイ、および計算シミュレーションにより、BHのループからヘリカルへの遷移と屈曲がRNA-DNAハイブリッド増殖のアロステリックトリガーであることが明らかになった。これらの変化は、これまでに報告されているBHとRuvCモチーフIIのヘリックス1の連動リモデリング、および成長するハイブリッドに適応するために必要なRECローブの動きと一致している。BHの遷移は「蓋」のループからヘリカルへの遷移に不可欠であり、これによりRuvC活性部位ポケットが開き、DNAが進入して切断される。
研究チームは、先行論文の成果と今回の成果を合わせて、Cas12ファミリーとCas9ファミリーのBHとRuvCのペアワイズ3D構造比較は、これらのメカニズムが類似する酵素におけるBHの構造的構成の多様性についての洞察を提供すると主張している。
[＊] 構造情報
- PDB 9MKT/EMD-48337: FnoCas12a<KD2P>-state 1
- PDB 9MKU/EMD-48338: FnoCas12a<KD2P>-state 2
- PDB 9MKV/EMD-48339: FnoCas12a<KD2P>-state 3
- PDB 9MKW/EMD-48340: FnoCas12a<KD2P>-state 4a
- PDB 9MKX/EMD-48341: FnoCas12a<KD2P>-state 4b.
[Cas12a関連crisp_bo記事]
- CRISPRメモ_2017/08/07 [第2項] CRISPR-Cpf1が多様なPAMを認識する構造基盤.
- 2021-05-07 Cas12aのRECとNUCドメインの連結に寄与するブリッジヘリックスのCas12a活性への寄与. https://crisp-bio.blog.jp/archives/26265440.html；... Cas12aは、N末端側のRECローブとC末端側のNUCローブが，wedge (WED)ドメイン，RECドメイン内のREC1ドメインおよび
ブリッジヘリックス (BH)を介して連結された二重ローブ構造の酵素である [Nucleic Acids Research誌刊行論文のFigure 1の一部引用右図参照] - 2025-07-27 CRISPR-Cas12aシステムが標的DNAを認識・結合・切断する際に形成されるRループの動態. https://crisp-bio.blog.jp/archives/39003068.html
[出典]
- "Bridge helix of Cas12a is an allosteric regulator of R-loop formation and RuvC activation" Ganguly C [..] Rajan R. (bioRxiv 2025-01-10). Nat Commun. 2026-01-28. https://doi.org/10.1038/s41467-026-68657-0 [所属] University of Oklahoma (Chemistry and Biochemistry) (米国), Brandeis University.
[＃] 先行論文：Cas12aのBHは、シスDNA切断に選択性を付与し、トランスDNA切断を制御する。
Rakhi RajanらはCas12aシステムの解析以前に、Streptococcus pyogenes（Spy）Cas9においてブリッジヘリックス（BH）のプロリン置換が標的DNA切断選択性を付与することを示していた。ここでは、Francisella novicida 由来のCas12aのBHバリアント（FnoCas12a<K969P/D970P>；以下, FnoCas12a<KD2P>）を解析し [論文Fig. 1参照]、その結果、BHが標的dsDNAのシス切断とssDNAトランス切断（コラテラル活性）の両方において基質選択性に関与していることを示唆し、Casヌクレアーゼ間の標的識別において保存された役割をになっているとした。
[出典] "The bridge helix of Cas12a imparts selectivity in cis-DNA cleavage and regulates trans-DNA cleavage" Parameshwaran HP [..] Rajan R. FEBS Lett. 2021-02-28/Apr. https://doi.org/10.1002/1873-3468.14051 [所属] University of Oklahoma, University of Sothern California.
[出典] "The bridge helix of Cas12a imparts selectivity in cis-DNA cleavage and regulates trans-DNA cleavage" Parameshwaran HP [..] Rajan R. FEBS Lett. 2021-02-28/Apr. https://doi.org/10.1002/1873-3468.14051 [所属] University of Oklahoma, University of Sothern California.
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