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｜CRISPR

　CRISPR-Casエフェクターは、ガイドRNAに依存するRNA誘導型ヌクレアーゼの一種であるが、慎重に設計したRNA -DNAハイブリッドなガイドRNAが効果的な場合がある。

[慎重な設計]

　ハイブリッドガイドガイドRNAは「スペーサー」配列と「スキャフォールド」配列で構成されている [Figure 1引用右図参照]

　標的ゲノムDNAと対合する約20塩基の「スペーサー」配列は、「シード配列」（スペーサーの3'末端にある8～10塩基）と「テール配列」（残りの塩基）で構成されている。シード配列における配列ミスマッチはCRISPRの効率を劇的に低下させ、DNA置換も同様にCas9とCas12の両方による切断をほぼ阻害する [＃1, 2]。一方、テール配列はミスマッチに対してはるかに寛容であり、Cas9とCas12の両方で活性を維持しながら、大部分または全体をDNA塩基に置換できる[＃1, 2]。

　スキャフォールド配列は、ゲノムDNAと接触することはなく、Casエフェクターがそのフォールド、特にリピート：アンチリピート二重鎖を特異的に認識する。Cas12はこの領域のRNAの2’-OHを認識し、DNA置換によって切断が劇的に減少する [＃2]。 Cas9 の場合、特定のタンパク質接触塩基を避ける限り、ゲノム編集を大幅に低下させることなく、スキャフォールド配列の一部を置換できる [＃1]。

[ハイブリッドガイドのメリット]

  • オフターゲット活性の低減：末端配列にDNA塩基を導入すると、ゲノム結合複合体の安定性が低下し、Casエフェクターのミスマッチに対する許容度が低下し、ゲノム内の潜在的なオフターゲット部位が減少する。
  • オンターゲット効果は同等：配列が完全に一致する場合、複合体はDNA置換によって破壊されないほど安定しています。オフターゲット効果の低減と相まって、ハイブリッドガイドの特異性は向上する。
  • アデニン塩基エディター（ABE）によるバイスタンダー編集の低減 [＃3]：ただし、その機構はまだ不明であり、他の塩基エディターではまだ検証されていない
  • 低コスト：DNAの合成はRNAの合成の方が安価であり、多くのガイド必要とするハイスループットアプリケーションにとって特に有利な点である。

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[出典]


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