Cas12aとCas13aのバイオセンサーにおいて, 活性化因子にホスホロチオエート修飾を施すことで, 前増幅無しで, それぞれ検出限界500 aMと5 fMを達成 : crisp

背景

　CRISPR/Casシステムは、ゲノム編集のツールを提供するだけでなく、分子診断のツール（CRISPR Dx）も提供している。CRISPR Dxの中でも、CRISPR/Cas12aとCRISPR/Cas13aをベースとしたツールは、そのシス切断とトランス切断の両方の活性を活かして、今でも絶え間なく新たな提案がなされ、利用されている。しかし、これまでのツールは、本質的に「1ターゲット、1活性化」のターンオーバーメカニズムによって制約されている。この線形シグナル増幅は、感度をピコモル（pM）範囲に制限し、低存在量のバイオマーカーの微量分析には不十分なため、一般的に、外部の酵素を組み合わせることが多い。しかし、この２種類の反応を統合するアプローチはシステムの複雑さを増大させ、適合性の低さや標的競合といった課題をもたらし、複雑な生物学的マトリックス、特に細胞内環境への適用を制限している。したがって、高感度かつ信頼性の高い細胞内解析の要求を満たすために、「1標的、多数活性化」の指数関数的増幅が可能なCRISPR/Casシステムを設計することが求められている。

　核酸基質を介した自己触媒フィードバックループの設計は、CRISPR/Casの指数関数的増幅を実現するための有望な戦略である。これは通常、Cas酵素の活性化因子とトランス切断の基質の両方として機能する多機能DNAプローブを設計することによって実現される。トランス切断後、プローブは活性化因子を放出し、それが次に他のCas酵素を活性化することで、自立した基質駆動型シグナル増幅カスケードが形成される。このメカニズムは、改変されたDNA二次構造を使用して活性化因子を物理的にマスクし、Cas酵素による非特異的活性化と偶発的なトランス切断の両方から保護することで、実装されている。たとえば、立体障害を利用して二本鎖DNA（dsDNA）活性化因子のアクセスをブロックする環状DNAプローブを開発し、アトモル（aM）レベルの感度が実現されている。しかし、このようなプローブは合成が複雑で環化効率が低いことが、大きな課題になっている。あるいは、一本鎖DNA（ssDNA）活性化因子をカプセル化するヘアピンDNAプローブも研究されてきた。この手法では、遊離した活性化因子はCas12aのトランス切断によって除去される可能性が、大きな課題になっている。こうした状況から、安定的かつ効率的なCasの指数関数的増幅を保証する、よりシンプルで堅牢な基質を設計することが求められている。

成果

　ホスホロチオエート（phosphorothioate）核酸（PS DNA/RNA）は化学的に修飾された核酸分子であり、ヌクレアーゼによる分解に対して強い耐性を特徴とし、生物学的用途において極めて耐久性の高いツールとなっている。研究チームは、完全にPS修飾された活性化因子が疎水性アンカーによってCas12aを「閉じた」（不活性な）構造にリクルートできることを発見し、さらに、PS修飾部位を調整した、「散在した（scattered）」修飾パターンがこの疎水性効果を減弱させ、酵素活性化とヌクレアーゼ耐性を効果的に切り離し、最終的にCas12aの高い活性を回復することを発見した。

　Cas12a が PS 修飾間の 3 つ以上の未修飾結合を含むスペーサーを効率的に切断するという観察に基づき、STx-y と名付けた二機能性「コーディネーター」プローブを設計した

[Figure 3引用右図A参照]。このプローブは、トランス切断基質と活性化因子として同時に機能することにより、CRISPR/Cas 自己触媒反応を調整するように設計されている。具体的には、PS 修飾活性化因子に未修飾のランダム配列 (z 領域) を挿入し、これを x と y の 2 つのセグメントに効果的に分割した。Z 領域は 2 つの目的を果たしている。1 つは活性化 Cas12a の指定切断部位として、もう 1 つはcrRNA との熱力学的結合を阻害することで非特異的活性化を防ぐ立体ブロッカーとして機能する。切断により、遊離した x および y 断片 (STx および STy) は協力して他の Cas12a 酵素に結合し、活性化します。この設計とレポータープローブを用いることで、Scattered PS Nucleic Acid-driven Cas Autocatalytic system（SACA）を構築した。

　SACAはCas12aベースとCas13aベースのアッセイで、それぞれ驚異的な500 aM、5 fMという極めて低い検出限界（LOD）達成し、従来の方法を大きく凌駕した（それぞれ50,000倍と10,000倍の感度向上）。

　拡散配列の複雑な二次構造と比較して、PS修飾プローブは一本鎖の直鎖状態を維持しながら活性化因子を効率的にマスキングするため、設計がシンプルで、生体安定性に優れ、耐干渉性がより強力である。さらに、SACAは生物学的応用において優れた適合性を示し、子宮頸がん細胞におけるHPV16およびHPV18の効率的なマルチプレックスin situ検出を可能にした。

　この発見は、Cas酵素の自己触媒増幅におけるPS核酸プローブの応用の先駆的研究であり、複雑な細胞環境における高精度なin situ分析を進歩させるものである。

[出典]

"A tailored phosphorothioate coordinator enables CRISPR/Cas in-situ amplification" Yang T, Tang M, Xu L [..] Cheng W. Nulceic Acids Res. 2026-03-03. https://doi.org/10.1093/nar/gkag187 [所属] The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University (The Center for Clinical Molecular Medical Detection; The Biobank Center), Zhejiang University (Institute of Bioengineering), ZJU-Hangzhou Global Scientific and Technological Innovation Center, Zybio Inc.

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