[注] POLR3A 遺伝子は、RNAポリメラーゼIII（Pol III）を構成するサブユニットで最大のRPC1をコードしており, その変異は、Pol III関連白質ジストロフィーを代表とする先天性大脳白質形成不全症に紐づけられている。また、POLR3A 遺伝子には80を超えるミスセンス変異が知られているが、そのうちどれだけがスプライシング異常を引き起こして疾患をもたらすかは不明である。
一般に、pre-mRNA（mRNA前駆体）のプライシングは、高等真核生物においてイントロンを除去しmRNAを生成する基本的なプロセスであり、それにはイントロンの開始と終了にある標準的な配列モチーフや、スプライス部位から遠位に位置する多様な調節シスエレメント*が関与している。
[*] エクソンスプライシングエンハンサー（ESE）、エクソンスプライシングサイレンサー（ESS）、イントロンスプライシングエンハンサー（ISE）、イントロンスプライシングサイレンサー（ISS）、および構造エレメント
ヒト遺伝性疾患の約10%は、標準的なスプライス部位モチーフの変異によって引き起こされるが、調節シスエレメントの機能喪失につながる変異は、ヒト遺伝性疾患全体のさらに25%を占めている。しかし、疾患の原因となる調節シスエレメントの変異を特定することは容易ではない。シャーブルック大学のBenoît Chabot教授が率いるカナダの研究チームは今回、CRISPR技術を利用して、POLR3A 遺伝子に関連する疾患の原因となるミスセンス変異が、pre-mRNAスプライシング異常を引き起こすかどうかを検討した。
研究チームは、RNAを標的とするCas13Rxの不活性版dCas13RxとガイドRNA（gRNA）の複合体がgRNAの標的領域に結合することで生じる立体障害によってスプライシング調節が阻害する現象を利用することで、特定の部位における変異がスプライシングに与える影響を確認した。
EcR293細胞を対象とするgRNAのライブラリーを用いたスクリーニングの結果、疾患原因となるミスセンス変異が存在する POLR3A エクソン領域の20%にエクソンの取り込みを促進する要素が存在することが明らかになった。
さらにミニ遺伝子（minigene）を用いた実験により、これらの反応性エクソン領域に存在する変異はエクソンスキッピングを引き起こすことが確認された。
そこで、POLR3A 遺伝子の2つのエクソンに着目し、サイレンサーとして機能する近位イントロン領域をCRISPR-dCas13Rxシステムを用いて同定した。特筆すべきは、これらのgRNAの配列に対応する2'-O-メチル（2'OMe）オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド：ASO）も、変異エクソンの取り込みを促進したことである。
こうして、POLR3A 遺伝子におけるいくつかの疾患原因となるミスセンス変異がpre-mRNAスプライシングを変化させることを明らかにし、ミスセンス変異によって引き起こされる病態形成において、スプライシング調節異常が潜在的に大きな役割を果たしている可能性が示唆された。ひいては、スプライシング異常を修復できるgRNAおよびASOを発見することで、POLR3A関連神経疾患に適用可能な新たな治療法の可能性が示された。
[詳細]
研究チームは、POLR3A を標的とし、8 つのエクソンにわたる病原性ミスセンス変異と重複する 10 種類の異なる gRNAsにdCas13Rxと組み合わせて EcR-293 細胞にトランスフェクションして、初期スクリーニングを行った。その結果、エクソン 14 を標的とする gRNA とエクソン 26 を標的とする gRNA の 2 つが、エクソンのスキッピングを引き起こし、標的とされているエクソン配列が ESE を保持していることを裏付けた
[CommentaryのFig. 1引用右図参照]。さらに、POLR3A の病原性ミスセンス変異の約 20% が ESE を消失させ、かつ/または ESS を生成することが示唆された。
[CommentaryのFig. 1引用右図参照]。さらに、POLR3A の病原性ミスセンス変異の約 20% が ESE を消失させ、かつ/または ESS を生成することが示唆された。 エクソン 14 および 26 内の特定の変異の影響を特定するために、2 つのミニ遺伝子 が利用された。1 つはエクソン 13 からエクソン 15 までのゲノム配列を帯び、もう 1 つはエクソン 25 からエクソン 27 までのゲノム配列を帯びている。予想どおり、gRNA 標的領域への病原性ミスセンス変異の挿入は、POLR3A エクソン 14 および 26 のスキッピングを促進した [CommentaryのFigure 2引用右下図左側参照]。興味深いことに、わずか 3 つのヌクレオチドしか離れていないにもかかわらず、1797G>C 変異と 1800C>T 変異の間で、エクソン 14 のスキッピングの程度が大きく異なった。
1797G>C によるエクソン 14 のスキッピングは中程度であったが、1800C>T はほぼ完全なスキッピングを引き起こした。これらの結果は、特定のモチーフ内の異なる位置がスプライシングに異なる影響を与える可能性があるという、スプライシング制御の複雑さを強調している。 1800C>T変異がエクソン14のスプライシングに大きな影響を与えたのと同様に、3392A>G変異はエクソン26の大規模なスキッピングを引き起こした。ミスセンス変異がエクソン14と26のスプライシングに及ぼす影響は、EcR-293、ヒト乏突起膠腫、MO3.13細胞を含む、使用した3つの細胞株すべてで確認され、これらのエクソンのスプライシングが細胞特異的因子によって駆動されていないことが裏付けられた。
1797G>C によるエクソン 14 のスキッピングは中程度であったが、1800C>T はほぼ完全なスキッピングを引き起こした。これらの結果は、特定のモチーフ内の異なる位置がスプライシングに異なる影響を与える可能性があるという、スプライシング制御の複雑さを強調している。 1800C>T変異がエクソン14のスプライシングに大きな影響を与えたのと同様に、3392A>G変異はエクソン26の大規模なスキッピングを引き起こした。ミスセンス変異がエクソン14と26のスプライシングに及ぼす影響は、EcR-293、ヒト乏突起膠腫、MO3.13細胞を含む、使用した3つの細胞株すべてで確認され、これらのエクソンのスプライシングが細胞特異的因子によって駆動されていないことが裏付けられた。 スプライシング調節シスエレメントのESEとISE内の変異の結果は、ESSまたはISSの変異または隔離によって逆転する可能性があると予想される。そこで、病原性ミスセンス変異1797G>C、1800C>T、および3392A>Gを持つPOLR3A ミニ遺伝子のエクソン14および26の上流および下流のイントロン配列を標的とするgRNAを使用した実験を行ったところ、gRNAによって標的とされた複数のイントロン領域が、エクソン14および26のスプライシングにさまざまな程度の刺激効果をもたらすことが、明らかになった。最も強い刺激効果は、それぞれエクソン14および26の上流約60 ntのイントロン配列を標的とするgRNA（I13-5 gRNA および I25-5 gRNA）で捉えられた。エクソンスキッピングへの影響が中程度の1797G>C変異の場合、I13-5 gRNA/dCas1dによってエクソン14の包含がほぼ完全に回復した [先のFigure 2引用上図の右側]。しかし、1800C>Tおよび3392A>Gは重篤な変異であるため、I13-5およびI25-5 gRNAによるエクソン14および26の取り込みは部分的にしか回復しなかった。
次に研究チームは13-5およびI25-5 gRNAのアニーリング位置に対応する配列を標的とするASOの効果を評価した。その結果、dCas13Rxと複合体を形成したgRNAの部位特異的なリクルートメントが、ASOを介したスプライシング補正の潜在的な治療標的としてスプライシング制御エレメントの初期発見に利用できるという原理が成立することが確認された。
しかし、dCas13d/gRNAベースのアプローチには、gRNAの長さが長いため、制御エレメントの境界を定義する際の粒度が不足するという弱点があり、関心のある各塩基を複数のgRNAで標的にするか、ミニジーンでさらに検証する必要がある。さらに、ASOのサイズとアニーリングの位置がスプライシングの結果を劇的に変える可能性があることから、治療用ASOのサイズと化学修飾を、特定の変異に合わせて慎重に調整する必要がある。
POLR3A 関連白質ジストロフィーおよび神経疾患における臨床的多様性と多数のミスセンス変異を考慮すると、POLR3A における変異誘発性スプライシング異常の体系的なマッピングが、精密なRNA標的治療の開発に向けた重要なステップとなる。
今回得られた知見は、RNA標的型Cas13システムは、スクリーニングプラットフォームとしての役割に加え、スプライシング調節のための直接的な治療薬としても有望なことも、示している。触媒活性を失活させたCas13変異体は、特定のmRNA前駆体の領域に結合し、エクソンの挿入またはスキッピングに影響を与えるようにプログラムすることができ、ベクターを介した送達によってアンチセンスオリゴヌクレオチドに代わる、持続的な代替手段となる可能性がある。原理的には、このようなアプローチによって、持続的かつ調整可能なスプライシング補正が可能になる。
しかし、効率的な送達、発現レベルの制御、免疫原性、オフターゲットRNA相互作用の最小化など、重要な課題が残っている。現在、ASOは臨床的に確立された治療法であるが、RNA標的型CRISPR技術の継続的な改良により、精密なRNA調節のための治療ツールキットが拡大する可能性がある。
[出典]
- 論文 "RNA-Based Discovery and Correction of Splicing Defects Caused by POLR3A Missense Mutations" Shkreta L, Delannoy A, Toutant J, McSwiggen J, Chabot B. Mol Ther Nucleic Acids. 2026-01-29. https://doi.org/10.1016/j.omtn.2026.102850 [所属] Université de Sherbrooke (RNA Group, Dept Microbiology and Infectious Diseases) カナダ, Quebec Network for the Development and Production of RNA Therapies (Réseau DePTAQ) , McSwiggen Biotech Consulting LLC；グラフィカルアブストラクト
- Commentary "Harnessing CRISPR-dCas13Rx to identify novel antisense targets for therapeutic splicing modulation" Singh RN, Alves CRR. Mol Ther Nucleic Acids. 2026-03-22/June. https://doi.org/10.1016/j.omtn.2026.102895 [所属] Iowa State University (Dept Biomedical Sciences), University of Pittsburgh (Dept Pathology)
コメント