[背景]
RNA分子は細胞内で、mRNA、長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）、あるいは、外来性病原性RNAなど、遺伝子制御と細胞恒常性において中心的な役割を担っている。これらのRNA分子の存在量、局在、および動態は厳密に制御されており、これらのプロセスの調節異常は様々な疾患と関連している。したがって、生細胞におけるRNAの可視化は、生体分子との相互作用、空間配置、輸送機構、および刺激応答性動態を解明するために不可欠である。
生細胞でRNAの動態を捉える可視化技術として、蛍光RNAアプタマーやMS2-MCP標識システムなどが開発されてきたが、これらの方法はしばしば外因性色素や大規模なRNAエンジニアリングを必要とし、天然RNAの機能を阻害したり、バックグラウンドノイズを発生させたりする可能性を伴っている。近年、RNAを標的とするCRISPRタンパク質Cas13を不活性化したdCas13と、そのガイドRNA（crRNA）を組み合わせることで、遺伝子改変を伴わずに内因性RNAの配列特異的標識を可能にするモジュール式のRNA可視化システムが登場し、信号対雑音比（SNR）を向上させるために、特異性の向上とバックグラウンド蛍光の低減が追究されている。
例えば、蛍光タンパク質とTat-デグロンドメイン（tDeg）を組み合わせたシステムは、最適化されたTAR RNA変異体Pepperなどの人工RNA足場に結合すると、蛍光を選択的に安定化させることができる[crisp_bio 2019-09-15] 。この条件付き安定化の原理は、従来のRNA標識システムにも応用されている。例えば、MS2コートタンパク質のデグロンマスク変異体（dMCP）は、RNA結合時にのみ安定化することで、単一mRNAの高感度かつ低バックグラウンドイメージングを可能にする [crisp_bio 2025-09-27]。しかし、これらの足場またはタグ依存型の戦略は効果的ではあるものの、一般的に標的RNAの修飾を必要とするため、天然転写産物への適用が制限される [crisp_bio 2024-07-02]。
tDegの概念に基づき、fCRISPRではsgRNAにPepperモチーフを組み込むことでDNAの可視化が実現された [Zhang et al., Nat Commun 2024]。しかし、tDegとPepperの自発的な相互作用による非特異的蛍光という問題を伴っていた。また、smLiveFISHでは、最大48個のガイドRNAを持つCRISPR-Csm複合体を用いて、未修飾の内因性RNAの単一分子解像度での可視化が実現された [crisp_bio 2025-02-24]。この方法は高感度ではあるが、長いRNA領域と反復性のcrRNAアレイを連結する必要があるため、多くの生理的転写産物への適用が制限されることが課題になっている。
[成果]
中国科学院深圳先進技術研究院Minghai Chen教授と中国科学院生物物理研究所の Xian-En Zhang教授が率いる中国の研究チームは今回、dLwasCas13a-crRNAをベースとするプログラム可能なRNAターゲティングと、tDegをベースとするデグロンを介したバックグラウンド抑制を統合した、遺伝子コード化RNAイメージングプラットフォームであるCtDeg（CRISPR–dCas13–tDeg）を開発した。
CtDegでは、crRNA足場内にPepperモチーフが組み込まれ、CRISPR-dCas13が標的RNAに結合時のみ蛍光が活性化され、結合していないタンパク質は選択的に分解される [グラフィカルアブストラクト引用下図(上)とFigure 1 - A引用下図(下)参照]。
C末端tDegバリアントを系統的に最適化し、シグナル対ノイズ比を最大化することで、CtDegが従来の蛍光タンパク質–CRISPRを用いたRNAイメージング手法よりも大幅に低いバックグラウンドと高い特異性を実現することを実証した。
C末端tDegバリアントを系統的に最適化し、シグナル対ノイズ比を最大化することで、CtDegが従来の蛍光タンパク質–CRISPRを用いたRNAイメージング手法よりも大幅に低いバックグラウンドと高い特異性を実現することを実証した。
CtDegを用いることで、パラスペックル集合の動態をリアルタイムで捉え、SARS-CoV-2ゲノムRNAの初期段階の輸送を可視化することに成功した。その中で、CtDegがウイルス誘導性NEAT1_2 lncRNA蓄積の初の直接的な可視化のエビデンスを提供し、宿主とウイルス間の制御的相互作用を明らかにしたことは、特筆に値する。
これらの応用以外にも、CtDegは複数のCas13オーソログや蛍光タンパク質と互換性があり、生細胞におけるRNAの局在、動態、機能を解析するための汎用性の高い標的誘導型プラットフォームとして確立され、合成生物学やRNA生物学において幅広い応用が期待される。
これらの応用以外にも、CtDegは複数のCas13オーソログや蛍光タンパク質と互換性があり、生細胞におけるRNAの局在、動態、機能を解析するための汎用性の高い標的誘導型プラットフォームとして確立され、合成生物学やRNA生物学において幅広い応用が期待される。
[出典]
- "Programmable, target-induced fluorogenic CRISPR–tDeg platform for live-cell RNA visualization" Zhong H, Zhou J, Qin F, Zhang XE, Chen M. Nucleic Acids Res. 2026-03-30/04-13. https://doi.org/10.1093/nar/gkag279 [所属] Huazhong University of Science and Technology (College of Life Science and Technology) (中国), Shenzhen Institutes of Advanced Technology CAS (State Key Laboratory of Quantitative Synthetic Biology; Faculty of Synthetic Biology), Institute of Biophysics (State Key Laboratory of Biomacromolecules)
コメント