CRISPR-Cas12aの活性化を制御することで、条件付き遺伝子編集と分子診断を実現することができます。陸軍軍医大学第一附属病院（西南病院）に四川大学生命科学部が加わった中国の研究チームが今回、前増幅不要の核酸検出と条件付き遺伝子編集のためのプラットフォームとして、TopCas（Topology-gated Cas12a via DNA-RNA Chimeric Circular crRNA / NA-RNAキメラ環状crRNAを介したトポロジー制御型Cas12a）を開発し、Advanced Science 誌刊行論文で紹介しています。
[詳細]
研究チームは、Cas12aの標的特異性とヌクレアーゼ活性化の両方を制御するcrRNAの重要な役割、RNAトポロジー、Cas12aの構造研究、およびそのトランス切断活性化特性からの知見、加えて、ゲノム編集特異性の向上と高感度核酸診断の実現におけるDNA-RNAキメラ核酸の有用性の知見に基づいて、TopCasを開発した [FIGURE 1引用右下図参照]。
TopCasシステムでは、標的分子 [図中のTarget] によって線状化されるまでCas12aの活性コンフォメーションを立体的に制限するDNA-RNAキメラ環状crRNAを設計した [図中のCcrRNA+CssDNA]。標的認識後、組み立てられた標的-crRNA-Cas12a複合体は環状ガイドのDNAセグメント [図中のDNA Linker] をトランス切断し、活性な線状形態 [図中のLssDNA] に変換して自己触媒的活性化カスケードを開始する。このカスケード反応により、外部増幅ステップが不要となり、高特異性かつ高感度なワンチューブ・ワンステップ蛍光アッセイが可能になりました。 この高感度核酸診断の実現に加えて、標的活性化型TopCasシステムは条件付き遺伝子編集も可能にしました。編集部位に特異的なキメラ環状crRNAを組み込むことで、自己触媒的な線状crRNA-Cas12a複合体が標的切断活性を獲得し、オフターゲット効果を大幅に低減した制御された遺伝子編集が可能になりました。
TopCasシステムの検証としてはまず、キメラcrRNAの効率的な
分子内環状化を実現し [FIGURE 2引用右図参照]、Cas12a活性を抑制する能力を確認し、この抑制を調節する因子を調査しました。次に、合成核酸をモデルとして、活性化速度、特異性、および検出限界を評価しました。さらに、TopCasシステムが前増幅なしで臨床検体を正確に検出できること、および生細胞中の標的分子をモニタリングできることが、実証されました。
分子内環状化を実現し [FIGURE 2引用右図参照]、Cas12a活性を抑制する能力を確認し、この抑制を調節する因子を調査しました。次に、合成核酸をモデルとして、活性化速度、特異性、および検出限界を評価しました。さらに、TopCasシステムが前増幅なしで臨床検体を正確に検出できること、および生細胞中の標的分子をモニタリングできることが、実証されました。 最後に、哺乳類細胞における条件付きゲノム編集を実施することで、TopCasの汎用性を示すに至りました。
TopCasは、特定のウイルスDNAまたはRNA標的が存在する場合にのみ条件付きで活性化されて、細胞遺伝子の精密な編集を実行することで、精密な疾患診断のための新たなツールであるに留まらず、個別化治療介入のツールとしても有望です。
[出典]
- "TopCas: Topology-Gated Cas12a via DNA-RNA Chimeric Circular crRNA for Amplification-Free Nucleic Acid Detection and Conditional Gene Editing" Zhang S, Sun W [..] Chen H, Chen M, Zhang J. Adv Sci (Weinh). 2026-03-30. https://doi.org/10.1002/advs.75046 [所属] Third Military Medical University (Army Medical University) (Dept Clinical Laboratory Medicine) (中国), Sichuan University (Key Laboratory of Bio-Resource and Eco-environment of MOE)
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- "A CRISPR-Cas12a integrated SERS nanoplatform with chimeric DNA/RNA hairpin guide for ultrasensitive nucleic acid detection" Yin B [..] Wong SHD, Yang M. Theranostics 2022-08-08. https://doi.org/10.7150/thno.75816
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