セファロスポリンC（CPC）は、アクレモニウム属の真菌から得られたセフェム系抗菌薬のベースとなっていますが、工業規模でCPCを生産できるのは唯一Acremonium chrysogenum に限られています。しかし、その遺伝子機能、高収率機構、および代謝工学に関する研究は、効率的なマルチプレックスゲノム編集ツールが存在しなかったことから制限されてきました。この制限を克服するために、華東理工大学を主とする中国の研究チームは今回、内因性tRNAプロモーターによって駆動される、迅速かつ効率的なCRISPR/Cas9ベースのマルチプレックスゲノム編集システムを開発し、A. chrysogenum において、ワンステップのマルチローカスノックアウト、大きな断片DNAの欠失、および遺伝子の過剰発現を可能にしました。
多くの株は特定の遺伝子に関連する目に見える表現型を欠いているため、強力なプロモーターの下で異種タンパク質mCherryを発現させることにより、視覚的に識別可能な赤い表現型を導入しました。野生型株では、20個の内在性tRNAプロモーターを評価し、異種であるAspergillus nidulans PgpdAプロモーターおよびAspergillus fumigatus U6プロモーターと比較した。その比較の結果、内在性tRNAValプロモーターが、最も高いノックアウト効率（95.5%）を示すことが明らかになりました。
こうして、tRNA-gRNAアレイベースのCRISPR/Cas9システムにより、工業用株においてドナーDNAなしで二重および三重のノックアウトが可能となり、それぞれ50.0～83.3%および14.3%の効率が得られました。これは、A. chrysogenum、特に工業用株における同時三重ノックアウトの最初の例となりました。
このシステムを用いることで、セファロスポリンC生合成と間接的に競合するソルビシリノイド生合成の遺伝子クラスターを含む50.7kbのDNA断片をほぼ100%の効率で除去することに成功し、高収量株においてCPC生合成に関わる主要遺伝子pcbAB の過剰発現が実現しました。その結果、CPC力価が5.59g/Lから6.92g/Lへと23.8%向上しました。
こうして、tRNA-gRNAアレイベースの多重化CRISPR/Cas9 GEシステムは、A. chrysogenum における機能ゲノミクスおよび工業用株工学のための効率的かつ汎用性の高いプラットフォームを提供するに至りました [グラフィカルアブストラクト参照]。
[出典]
- "A Versatile tRNA-gRNA Array-Based CRISPR/Cas9 Platform Enabling Multiplex Genome Editing and Large-Fragment Engineering in Acremonium chrysogenum" Chen Z [..] Tian X, Chu J. ACS Synth Biol. 2026-04-29. https://doi.org/10.1021/acssynbio.6c00052 [所属] East China University of Science and Technology (State Key Laboratory of Bioreactor Engineering) (中国), Fudan University (Center for Medical Research and Innovation), Shanghai Engineering Research Center of Industrial Microorganisms
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