ソウル大学校の研究者達に済州大学校の研究者が加わった韓国の研究チームが標題の生物学的封じ込め（Biocontainment）戦略を実装したことを、Nucleic Acids Reseach 誌刊行論文で紹介しています。
背景
生物学的封じ込めは、合成生物学分野において、産業、環境、治療用途で遺伝子操作された微生物（engineered microorganisms：GEM）の実用化にあたり、守らなければならい必須要件です。毒素-抗毒素キルスイッチや合成栄養要求株などの初期の遺伝子封じ込め戦略は、微生物の持続性を制限するための重要な原則を示し、その後の生物学的封じ込め技術の基盤となりました。一方で、異なる戦略は異なるアプリケーションコンテキストに合わせて最適化されたため、操作の簡便性、携帯性、応用範囲に関してトレードオフが生じました。このため、様々な菌株や用途への幅広い展開には課題が残りました。
近年、DNA二本鎖を切断する活性を帯びたCRISPR-Cas9をベースにした生物学的封じ込め戦略が、必須遺伝子機能を直接標的とすることで、毒素を用いずに細胞生存能力をプログラム可能に喪失させることを可能にし、従来の安全対策を強力に拡張するものとして登場しました。しかし、オフターゲット切断によって生じる有効性と、宿主（有用な遺伝子改変微生物）の適応度コストとの間に根本的なトレードオフが存在しました。この解消には、宿主の意図しない細胞死を防ぐために染色体への組み込みや多層的で複雑な制御アーキテクチャが必要となり、現場で求められる操作の簡便性と移植性に課題が残りました。CRISPR-Cas9と対照的に、ヌクレアーゼ欠損dCas9（CRISPRi）はこのような宿主の適応度のコストを消しましたが、その誘導の停止とともに失われる一時的で可逆的な抑制しか提供しない課題を伴いました。
研究チームの成果
研究チームは、Cas9（不可逆的だが毒性のある切断ベースの戦略）と、dCas9（毒性はないが可逆的な結合ベースの戦略）とのギャップを、DNA二本鎖切断を誘発することなくヌクレオチドを永続的に変換できるアプローチを可能にする塩基エディター（BE）で埋めることを発想しました。具体的には、C:G-to-T:A変換を実現するシトシン塩基エディター（CBE）をベースにして、開始コドンATGをATAに改変するアプローチを実装しました。
- まず、15種類のシングルガイドRNA（sgRNA）のin silicoスクリーニングとin vivo検証により、3つの高効率候補を特定しました。追加の制御機構を組み込むことで、編集ベースの必須遺伝子ターゲティング（editing-based essential gene targeting：eEG）モジュールを開発しました。
eEGシステムは、一時的な誘導後、堅牢で不可逆的な抑制を実現し、dCas9を介した干渉（dCas9-mediated interference：iEG）システムの可逆性を克服します [iEGとeEGを比較した模式図であるFig. 1を引用した右図参照]。- さらに、複数の必須遺伝子を同時に標的とするシステムへと展開し
[グラフィカルアブストラクト右図参照]、この多重化（multiplexed）eEGシステム（eEGM）が誘導後1時間以内にNIHガイドライン基準（10⁻⁸）を上回り、野生型コントロールと区別できない増殖速度を維持できることを、確認しました。 - このeEGMシステムは、10回の継代培養にわたって長期安定性を示し、宿主の異種遺伝子発現を阻害することなく、また、複数の大腸菌誘導体間で機能的な移植性を示しました。
本研究は、CBEが厳格かつ携帯可能な微生物バイオコンテインメントのための、操作効率が高くヌクレアーゼ非依存的なエフェクターであることを確立しました。
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[出典]
- "Multiplexed CRISPR base editing enables pulse-activated irreversible biocontainment of engineered bacteria" Cho SW, Kim T, Yang J, Byun G, Sea SW. Nucleic Acids Res. 2026-04-23/-08. https://doi.org/10.1093/nar/gkag422 [所属] Seoul National University (Dept Chemical and Biological Engineering; Institute of Chemical Processes; Bio-MAX Institute; Institute of Bio Engineering; Interdisciplinary Program in Bioengineering),(韓国), Jeju National University (Dept Chemical Engineering)
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