[背景]
CRISPR-Casシステムは、そのプログラム可能なRNA誘導型のヌクレアーゼを介して、ゲノム編集（GE）と革新的分子診断（CRISPR Dx）に広く応用されています。そのRNA誘導型のヌクレアーゼは多様であり、多因子型クラス1複合体、単因子型クラス２ヌクレアーゼに加えて、近年発見されたタイプV（Cas12）システムと関連するOMEGAファミリーのTnpBなどが存在します。
CasヌクレアーゼはCRISPR RNA (crRNA）に誘導され、TnpBはωRNAによって誘導されますが、標的認識には、標的に隣接する配列モチーフが必須であり、それぞれPAMとTAMと呼ばれています。したがって、GEにおいてもCRISPR Dxにおいても、PAM/TAMの要件を正確に特定することが、重要になります。
このため、PAM/TAMを同定する様々な計算手法と実験手法が開発されてきましたが、その中で、HT-PAMDA [＃]が特に強力かつ包括的なアプローチとして注目されています。
[＃] crisp_bio 2021-02-09/2021-03-25 [プロトコル] HT-PAMDA: 数十, 数百のCasエフェクターのPAMsを同時並行で２週間以内に同定する法.
HT-PAMDAは、大規模並列シーケンスを用いて、大規模なランダム化PAMライブラリ全体にわたるヌクレアーゼ切断を直接測定し、PAMの選択性を定量的かつ高解像度でマッピングすることを可能にします。HT-PAMDAは、数千もの配列にわたる切断結果を同時に捉えることで、ヌクレアーゼ特異性の詳細な情報を提供し、PAM発見のための貴重なフレームワークとなっています。
しかしながら、HT-PAMDAの実装には、複数の時点のライブラリが必要であり、ライブラリ設計とシーケンス構造に関する厳格な仮定に基づく柔軟性とスケーラビリティーに欠けるモノリシックな解析パイプラインに依存しているため、フロリダ大学のPiyush K. Jain准教授並びにCarlos Orosco院生とUSDA ARSのPIであるAdam R. Rivers博士の研究チームは今回、柔軟でアクセスしやすいフレームワークを開発し、TAMIPAMIとして、bioRxiv プレプリントにて発表しました。
[成果]
TAMIPAMIは、PAM/TAMを迅速に同定するための柔軟かつ効率的な実験および計算フレームワークです。TAMIPAMIは、単一のコントロールライブラリとCasまたはTnpB処理済みライブラリのみを必要とするため、実験設計が簡素化され、コストが削減され、ユーザーにとってアクセスしやすくなっています。
こTAMIPAMIは、インタラクティブな視覚化によってシーケンスデータを解釈し、観察されたPAM/TAMパターンを記述する最小限の正確な縮重IUPAC配列セットを決定する新しいアルゴリズムを導入しています。
このアプローチを使用することで、SpyCas9、LbCas12a、AsCas12a、Cas12i1、およびBrCas12bのPAM、ならびにAmaTnpBのTAMを実験データに基づいて正確に特徴づけることができ [Figure 1引用下図参照]、
ひいては、CRISPRおよびOMEGAヌクレアーゼの発見、エンジニアリング、および特性評価が改善されていきます。
TAMIPAMIは、Webアプリケーションとコマンドラインツールの双方にて利用可能で、前者は https://tamipami.che.ufl.edu にて [右図はそのスクリーンショット]、後者は https://github.com/USDA-ARS-GBRU/tamipami から入手できます 。[出典] "TAMIPAMI: Software and methods for PAM/TAM identification for CRISPR and OMEGA gene editing systems" Carlos Orosco (1), Piyush K. Jain (1), Adam R. Rivers (2). bioRxiv. 2026-05-16. (preprint) https://doi.org/10.64898/2026.05.15.725432
- University of Florida, Department of Chemical Engineering, Gainesville, Florida 32611
- United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Gainesville, Florida
- 32608
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