[レビュー] CRISPRバイオセンサーを支えるガイドRNAをプログラムする : crisp

　CRISPR-Casシステムは、核酸の高感度かつ特異的な検出を可能にする強力なバイオセンシング・プラットフォームとしても注目を集め、CRISPR Dx (CRISPR Diagnosis）という用語も生まれました。

　CRISPR Dxの性能は、標的を認識し、そのシス切断に加えて、トランス切断（コラテラル切断）も活性化させるアクチベーターとして機能するガイドRNA（gRNA）に左右されます。天然型のgRNAは、細胞内での安定性の低さ、ミスマッチ識別能の弱さ、臨床検体（マトリックス）中での活性低下、そして不安定なコラテラル切断活性といった課題を抱えることが多く、CRISPR Dxの応用に制約をもたらしてきました。

　こうした制約を克服するため、長さの変更、構造の再構築、DNA修飾、化学修飾、ミスマッチ導入、さらには複数の修飾を組み合わせたものなど、多岐にわたるgRNAエンジニアリング戦略が開発されてきました。[Fig. 1引用下図参照]

　これらの修飾は、Cas12aやCas13a、さらには新たに登場したCRISPRエフェクターにおいて、感度、特異性、安定性、およびプログラム可能性を大幅に向上させてきました。

　ニュー・サウス・ウェールズ大学 (UNSW Sydney) のFei Deng講師が責任著者となっているレビューでは、近年の進歩が体系的にまとめられ、作用機序や機能的成果が比較され、標的核酸の前増幅を必要としない検出系の実現、臨床現場での堅牢性の向上、そして次世代CRISPR Dxの開発を推進するための、合理的gRNAエンジニアリングの今後の展望について論じられています。

[注] 日本発のCONAN [crisp_bio 2020-06-07/2022-02-08] が2.2.8.1.節で取り上げられています。

[構成] 参考文献84件を含む24頁

1. Introduction
2. gRNA modification strategies for CRISPR-Cas12a
2.1. Single gRNA modification strategies
2.1.1. Length modulation of gRNA
2.1.1.1. Extension at 5'-end of gRNA
2.1.1.2. Extension at 3'-end of gRNA
2.1.1.3. Truncation at 5'-end of gRNA
2.1.2. Conformational engineering of gRNA
2.1.2.1. Split of gRNA
2.1.3. DNA modification of gRNA
2.1.3.1. Partial DNA replacement of native gRNA
2.1.3.2. Extension of native gRNA with DNA
2.1.3.3. Guide DNA
2.1.4. Chemical modification of gRNA
2.1.4.1. Photoactivation
2.1.4.2. Methylation
2.1.4.3. Phosphorylation
2.1.5. Mismatch design of gRNA
2.2. Combinatorial gRNA modification strategies
2.2.1. Splitting and recombination
2.2.2. Splitting and spacer replacement
2.2.3. Splitting and spatial hindrance
2.2.4. Loop opening and trigger insertion
2.2.5. Structural blocking and photo-triggered activation
2.2.5.1. Split and photo-caged strategy
2.2.6. DNA modification and circularization
2.2.7. Terminal extension and phosphorothioate modification
2.2.8. gRNA blocking and autocatalytic feedback amplification
2.2.8.1. CONAN [Fig. 8引用右図参照]
2.2.8.2. Autocatalytic dual-blocking CRISPR-cascade design
3. Cas13a gRNA modification strategies
3.1.1. Synthetic mismatch of gRNA in Cas13a
3.2. gRNA extension strategies
3.3. Conformational change of gRNA
3.3.1. Hairpin
3.3.2. Foldback
3.4. DNA-RNA hybridization-based gRNA design
3.4.1. DR region blocking strategy
3.4.2. Spacer region DNA occluder strateg
4. gRNA modification in other CRISPR systems
4.1. gRNA modification of Cas9
4.1.1. LEOPARD
4.1.2. AGATHA
4.2. gRNA modification of Cas12b
4.2.1. Split sgRNA of Cas12b
4.2.2. PUMA
4.3. gRNA modification of Cas12f1
5. Conclusion and outlook

[図表リスト]

Fig. 1. Schematic diagram of gRNA modification strategies for CRISPR biosensor.
Table 1. Comparison of gRNA Modification Strategies in CRISPR Biosensing.
Fig. 2. Length modulation of the gRNA.
Table 2. Summary of single gRNA modification strategies for Cas12a.
Fig. 3. Conformation engineering of gRNA.
Fig. 4. DNA modification of gRNA.
Fig. 5. Chemical modification of gRNA.
Fig. 6. Split-based multiple modification strategies.
Table 3. Summary of combinatorial gRNA modification strategies for Cas12a.
Fig. 7. Photoactivation based multiple modifications.
Fig. 8. Autocatalysis-driven feedback design.
Table 4. Summary of Cas13a gRNA modification strategies.
Fig. 9. Single modification for Cas13a gRNA.
Fig. 10. gRNA modification in other CRISPR systems

[出典] "Engineering gRNA for CRISPR biosensing: chemical, structural, and programmable designs for ultrasensitive diagnostics" Wenyu Fu (1) [..] Fei Deng (1,9). TrAC - Trends Anal Chem. 2026-06-09. https://doi.org/10.1016/j.trac.2026.118960

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