[注] STAR Protocols誌のQ&Aシリーズは2026年6月に入ってから、 18日にOrganoids、19日にNeuroimaging とRNA-seq が、オンライン出版されてきたようです。
CRISPR技術は、細胞株やモデル生物における精密な遺伝子編集を可能にする、ゲノム工学分野のパラダイムシフトをもたらした革新的な技術です。生物学的研究や臨床研究においてCRISPR技術を成功裏に活用するには、確実なプロトコルとトラブルシューティングの手法が不可欠です。ここでは『STAR Protocols』誌の著者や諮問委員会のメンバーが、CRISPR技術、ゲノム編集戦略、トラブルシューティングのアプローチに関するよくある質問について、アドバイスを共有します。
CRISPR技術は、細胞株やモデル生物における精密な遺伝子編集を可能にする、ゲノム工学分野のパラダイムシフトをもたらした革新的な技術です。生物学的研究や臨床研究においてCRISPR技術を成功裏に活用するには、確実なプロトコルとトラブルシューティングの手法が不可欠です。ここでは『STAR Protocols』誌の著者や諮問委員会のメンバーが、CRISPR技術、ゲノム編集戦略、トラブルシューティングのアプローチに関するよくある質問について、アドバイスを共有します。
[項目リスト]
- 最適なシングルガイドRNA（sgRNA）を設計するために、どのようなツールがお推奨されますか？
- オフターゲット検出には、どのようなツールや手法が推奨されますか？
- 最も推奨されるCRISPRスクリーニングの手法は何ですか？利用可能なライブラリはありますか？
- 実験研究者がスクリーニング解析を行う際、どのような計算ツールが推奨されますか？
- 適切なコントロール用ガイドRNAとはどのようなものですか？
- 編集に失敗した場合、その原因がガイド、送達システム、あるいはゲノム領域の特性のいずれにあるかをどのように判断しますか？
- ノックイン（<2 kb）に理想的なレベルを見極めるために、染色体切断の相対的なレベルをどのように定義しますか？
- HDR（相同組換え修復）とNHEJ（非相同末端結合）修復の比率を大幅に向上させることが実証されている低分子阻害剤は何ですか？
- CRISPRを用いたノックインの効率を向上させるにはどうすればよいですか？
- （私の場合）CRISPRの効率が非常に低く、シングルセルソーティング後に細胞が死滅し続けてしまいます。これらの問題のトラブルシューティングについてアドバイスはありますか？
- ノックイン（<2 kb）において、ホモロジーアームの理想的な長さはどれくらいですか？また、長いノックイン（>5 kb）の場合はどうですか？
- ホモロジーアーム内に長い反復DNA配列が含まれると、HDRの効率にどのような影響がありますか？
- 長いノックイン（>5 kb）用の長い一本鎖DNAドナーは、どのように作製できますか？
- 選択マーカーをノックインする場合、Cas9とsgRNAをコードするプラスミドと共に、プロモーターとレポーター（例：CMV-GFP）を含むPCR増幅断片をトランスフェクションすることは可能ですか？
- 細胞株のSNPを修正するためのHDRテンプレートにおいて、効率を高めるために通常はPAM配列やgRNA標的配列にサイレント変異を導入します。イントロン内ではサイレント変異を導入できないため、イントロン内のSNPを修正する最善の方法は何ですか？
- 2つ質問があります。(1) 増殖能の低い初代細胞は、一般的にCRISPR-Cas9ゲノム編集効率が低いと結論付けて良いでしょうか？ (2) 編集効率が低いと予想される場合でも、CRISPR-Cas9実験を試みるために推奨される増殖能の低い初代細胞の最小数はどれくらいですか？
- CRISPR RNPのための安全かつ効率的なin vivo送達システムを開発する必要があります。何か提案はありますか？
- FACSを用いた単一細胞分離後のiPSCの回収率が低いこと、およびssODNテンプレートを用いたHDRの効率が低いことに悩んでいます。トラブルシューティングのための提案はありますか？
- （当研究室で分離した）シュードモナス（Pseudomonas？？？）属の細菌において、同一のプロモーター制御下で複数のsgRNAを発現させることに苦労しています。トラブルシューティングのアドバイスをいただけますか？
- 塩基エディターでは、CRISPRを用いてどのように配列を改変するのでしょうか？
[注] それぞれの問いに数名が回答しています。回答の中には、関連するWebサイトや論文が含まれてい場合がありますが、最後に、関連するSTAR Protocols 記事が16件挙げられています。
[出典] BACKSTORY "STAR Protocols question-and-answer series: CRISPR" Leila Shokri. STAR Protoc. 2026-06-22/Sept. https://doi.org/10.1016/j.xpro.2026.104600
1 STAR Protocols, Cell Press.
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