~ アストラゼネカにIntegrated DNA Technologies（IDT）が加わった研究チームからの報告 ~
CRISPR RNP導入後、10～14日間の単一細胞増殖（クローン増殖）期間を設けることで、単一細胞レベルでの編集イベントを、Integrated DNA Technologies (IDT）社が開発しCRISPRゲノム編集結果の評価に利用されているrhAmpSeqを用いて捕捉するのに十分なDNA量を得るという、単一細胞編集解析ワークフローを確立しました [論文のFig1 参照] 。
RhAmpSeqは、RNAベースのプライマーとRNase H2を利用するアンプリコンシーケンシング法であり、数百組のプライマーペアを同一のPCR反応系で高精度に多重化することを可能にします。この手法により、単一細胞レベルで編集を施したマウス胚およびマウス胚性幹細胞（mESC）において、オンターゲット部位とオフターゲット部位の両方における編集イベントを同時に解析することが可能となりました。
CRISPR-Cas9 ゲノム編集システムは遺伝性疾患治療のツールとして期待されていますが、特に治療に関連する規模では、稀なオフターゲット変異や構造的変異が安全性の重要な懸念として残っています [後述の「背景」の項参照]。
ここでは、Cas9 のオフターゲット活性を in vitro で単一細胞解像度で捉えた上で、in vivo ではさまざまな組織にわたって捉えるためのワークフロー が確立・利用されました [後述の「ワークフロー」の項参照] 。
- クローン増殖させてCas9-sgRNA複合体（RNP）をエレクトロポレーションしたマウス胚とマウス胚性幹細胞において、個々の細胞がバルク分析では見逃されたイベントを含む、独自のオフターゲットおよび転座プロファイルを示すことが明らかになりました。
- 単一細胞の編集結果を、クロマチンのアクセシビリティー、転写、および DNA メチル化の測定結果と統合したところ、配列に依存しない特徴が Cas9 のアクセスと切断を調節し、クロマチンが開いていてメチル化が低いことを特徴とする領域が優先的に編集されることが示唆されました。
- Cas9 誘導性マウスモデルでは、臓器固有のオフターゲット スペクトル、DNA 修復経路の使用、インデルパターン、および組織間で顕著に変化する染色体転座が生じる傾向が明らかになりました。
これらの発見は、オフターゲット活性が細胞間で不均一であり、臓器間で状況に依存することを示しており、CRISPRベースのゲノム医薬品の安全性を向上させるために、望ましくない編集結果がもたらされるリスクをより正確に評価する必要があることを浮き彫りにしています。
研究チームは、「CRISPR-Cas9ヌクレアーゼによる療法前臨床開発においては今後、高感度の単一細胞分析と臓器特異的評価が求められる」としています。
背 景
CRISPRを用いたゲノム治療の開発において、オフターゲット変異や染色体異常といった意図しない編集事象の発生は、依然として最大の安全上の懸念事項の一つです。こうした意図しない編集事象を検出するツールの確立において大きな進歩を遂げてきました。
しかし、これまでにオフターゲット変異を調査した研究の多くは、細胞集団全体（バルク細胞集団）を対象に行われており、従来の検出法では捉えられない低頻度の変異を見落としている可能性があります。
しかし、これまでにオフターゲット変異を調査した研究の多くは、細胞集団全体（バルク細胞集団）を対象に行われており、従来の検出法では捉えられない低頻度の変異を見落としている可能性があります。
一般的に用いられるオフターゲット検出法は、次世代シーケンシング（NGS）の現在のエラー率やコストによる制約を受けており、変異頻度が約0.1%（細胞1,000個に1個の割合）を下回る変異を特定する際には、恣意的な閾値を設定せざるを得ない状況にあります。約2,000億個の肝細胞から構成されるヒト肝臓での治療的ゲノム編集を想定すると、これは約2億個もの肝細胞で生じている意図しないCRISPR変異を見逃すリスクがあることを意味します。
研究チームは最近、Duplex-seqを用いることで検出感度を10倍に向上させたオフターゲット検出法を開発しました [Nat Commun., 2023]。しかし、この検出感度に近い、あるいはそれ以下の頻度で存在する変異の有無を検証することは、依然として困難な課題です。
安全なゲノム領域で生じる極めて低頻度の変異は有害である可能性が低いため、適切に設計された治療用sgRNAにおいては、この制約は大きな問題とはならないかもしれません。しかし、疾患原因変異の修正など、特定の配列の編集によって治療効果が得られる場合、利用可能なsgRNAの選択肢が限られる可能性があります。そのような場合には、治療を進める前に、候補となるsgRNAについて包括的な実験的評価を行うことが不可欠です。これには、意図しない編集事象を徹底的に検出することに加え、有害な結果を招きかねない機能的影響を厳密に評価することも含まれます。
安全なゲノム領域で生じる極めて低頻度の変異は有害である可能性が低いため、適切に設計された治療用sgRNAにおいては、この制約は大きな問題とはならないかもしれません。しかし、疾患原因変異の修正など、特定の配列の編集によって治療効果が得られる場合、利用可能なsgRNAの選択肢が限られる可能性があります。そのような場合には、治療を進める前に、候補となるsgRNAについて包括的な実験的評価を行うことが不可欠です。これには、意図しない編集事象を徹底的に検出することに加え、有害な結果を招きかねない機能的影響を厳密に評価することも含まれます。
ワークフロー
研究チームは、オフターゲット編集は本質的に不均一な現象であり、個々の細胞が持つ固有の特性に依存しているという仮説を立てました。この仮説を検証するために、単一細胞懸濁液にエレクトロポレーション法でCas9とsgRNAの複合体であるCRISPR RNPを導入しました。
ここで、sgRNAとしては、Pcsk9 遺伝子を標的とする先行研究 [＊] で使用した2種類を使用しました。意図しないCRISPRオフターゲット編集を特定・解析するため、マウスゲノム内にsgRNA配列とのミスマッチ数が少ない（すなわち配列が高度に類似した）オフターゲット部位を多数有するように意図的に設計された（promiscuous-designed ）「gP」sgRNAを使用しました。この「gP」sgRNAは、先行研究において、解析対象とした複数の部位で生体内のオフターゲット編集を誘発したものです。対照的に、同研究において検出可能なオフターゲット編集が一切生じなかった高特異性「gMH」sgRNA（human PCSK9遺伝子と1塩基ミスマッチ）については、治療応用のモデルケースとして実験に加えました。
[＊] "In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations" Pinar Akcakaya, Maggie L. Bobbin [..] Marcello Maresca, J. Keith Joung. (AstraZeneca HMS/MGH) Nature 2018-09-12/09-20. https://doi.org/10.1038/s41586-018-0500-9
ここで、sgRNAとしては、Pcsk9 遺伝子を標的とする先行研究 [＊] で使用した2種類を使用しました。意図しないCRISPRオフターゲット編集を特定・解析するため、マウスゲノム内にsgRNA配列とのミスマッチ数が少ない（すなわち配列が高度に類似した）オフターゲット部位を多数有するように意図的に設計された（promiscuous-designed ）「gP」sgRNAを使用しました。この「gP」sgRNAは、先行研究において、解析対象とした複数の部位で生体内のオフターゲット編集を誘発したものです。対照的に、同研究において検出可能なオフターゲット編集が一切生じなかった高特異性「gMH」sgRNA（human PCSK9遺伝子と1塩基ミスマッチ）については、治療応用のモデルケースとして実験に加えました。
[＊] "In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations" Pinar Akcakaya, Maggie L. Bobbin [..] Marcello Maresca, J. Keith Joung. (AstraZeneca HMS/MGH) Nature 2018-09-12/09-20. https://doi.org/10.1038/s41586-018-0500-9
CRISPR RNP導入後、10～14日間の単一細胞増殖（クローン増殖）期間を設けることで、単一細胞レベルでの編集イベントを、Integrated DNA Technologies (IDT）社が開発しCRISPRゲノム編集結果の評価に利用されているrhAmpSeqを用いて捕捉するのに十分なDNA量を得るという、単一細胞編集解析ワークフローを確立しました [論文のFig1 参照] 。
RhAmpSeqは、RNAベースのプライマーとRNase H2を利用するアンプリコンシーケンシング法であり、数百組のプライマーペアを同一のPCR反応系で高精度に多重化することを可能にします。この手法により、単一細胞レベルで編集を施したマウス胚およびマウス胚性幹細胞（mESC）において、オンターゲット部位とオフターゲット部位の両方における編集イベントを同時に解析することが可能となりました。
この手法は、バルク集団に存在するすべてのオフターゲット変異を網羅的に明らかにするものではありません。むしろ、解析対象となる個々のクローンにおいて、特定の稀な変異の対立遺伝子頻度を実質的に「濃縮」させることで、それらの一部をランダムに検出するものです。
こうした理論的根拠と整合するように、今回の単一細胞解析では、バルク細胞集団の解析において十分なカバレッジ（深度）を確保していたにもかかわらず見落とされていたオフターゲット変異が特定されました。
一般的な従来法として十分な検出力を備えたバルク解析法を引き続き活用しつつも、今回の結果は、バルク解析では捉えきれない稀な事象や複雑な事象を把握する上で、単一細胞ベースのプロファイリングが有用であり、必要である、ことを、示しました。
こうした理論的根拠と整合するように、今回の単一細胞解析では、バルク細胞集団の解析において十分なカバレッジ（深度）を確保していたにもかかわらず見落とされていたオフターゲット変異が特定されました。
一般的な従来法として十分な検出力を備えたバルク解析法を引き続き活用しつつも、今回の結果は、バルク解析では捉えきれない稀な事象や複雑な事象を把握する上で、単一細胞ベースのプロファイリングが有用であり、必要である、ことを、示しました。
出 典
"Single-cell and in vivo profiling reveal heterogeneous and organ-specific CRISPR-Cas9 off-target and translocation outcomes" Madsen A (1), Selfjord N (1), Martinez-Lage M (1), Loyd AL (2), Kurgan G (3), Ståhlberg M (1), Lindgren J (2), Liz Touza J (2), Wigge L (4), Firth M (5), Nordström K (4), Collin J (2), Jachimowicz D (2), Schiffthaler B (4), Dillmann I (2), Antoniou P (1), Emmanouilidi A (1), Hellsten J (1), Forsström J (2), Magnell K (2), Jacobi A (3), Behlke M (3), Porritt M (1), Madeyski-Bengtson K (2), Maresca M (1), Akcakaya P (1). [26] Nat Commun. 2026-08-26. https://doi.org/10.1038/s41467-026-77144-5
- Genome Engineering, Discovery Sciences, BioPharmaceuticals R&D Unit, AstraZeneca, Gothenburg, Sweden.
- Translational Genomics, Discovery Sciences, BioPharmaceuticals R&D Unit, AstraZeneca, Gothenburg, Sweden.
- Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA.
- Data Sciences and Quantitative Biology, Discovery Sciences, BioPharmaceuticals R&D Unit, AstraZeneca, Gothenburg, Sweden.
- Data Sciences and Quantitative Biology, Discovery Sciences, BioPharmaceuticals R&D Unit, AstraZeneca, Cambridge, UK.
- Corresponding author
参 考
細胞型に依存するCas9によるゲノム編集プロファイルに関連するcrisp_bio記事とbioRxivプレプリント
細胞型に依存するCas9によるゲノム編集プロファイルに関連するcrisp_bio記事とbioRxivプレプリント
- 2020-05-07/2021-05-25更新 crisp_bio記事：クロマチン・コンテクストに応じてCas9誘導DSBからの修復過程が選択される. https://crisp-bio.blog.jp/archives/22855309.html
- 2025-10-23 bioRxivプレプリント：ゲノム編集において、細胞型ごとに特有なDNA修復結果が生じる：Cell-stereotyped DNA repair outcomes are widespread during genome editing. Moritz F. Schlapansky [..] Jacob E. Corn. https://doi.org/10.1101/2025.10.23.684114；トランスクリプトームとそれに対応する多対立遺伝子（マルチアレル）の編集結果を同時に解析できる拡張性の高い手法「scOUT-seq（single-cell Outcomes Using Transcript sequencing）」を開発；74種類の細胞タイプにわたる50万個の対立遺伝子を解析した結果、多くの細胞サブタイプにおける編集結果は、バルク解析による平均値とは著しく異なることを発見；細胞特性に応じた最適化された治療的ゲノム編集の可能性を示唆
- 2025-11-20 crisp_bio記事：ニューロンをはじめとする非分裂ヒト細胞におけるCRISPR修復効果の特性評価と制御. https://crisp-bio.blog.jp/archives/39686274.html；ゲノム編集は遺伝性疾患の治療に革命をもたらす可能性を秘めているが、その治療可能性を広げるには、ゲノム編集によるDNA修復効果と制御の理解が、まだまだ不十分である；遺伝的に同一の分裂細胞と比較して、ニューロンにおけるCRISPR編集の効果は、劇的に異なる。
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