~ CRISPRi/koスクリーニングでは捉えられなかった一連の遺伝子も発見〜

CRISPRaとは

CRISPRa（CRISPR activation/CRISPR活性化）は、標的特異的な遺伝子発現を実現・亢進するCRISPR技術の応用形態です。標準的なCRISPR技術では、Casヌクレアーゼタンパク質（Cas9など）を用い、sgRNAの誘導によって目的のゲノム領域にDNA二本鎖切断を導入します。

一方、CRISPRaでは、ヌクレアーゼ活性を欠失させたCasタンパク質（dCas9など）を使用します。この不活性型Cas9に、転写活性化ドメイン（transcriptional activation domains: TAD）をあらかじめ融合させるか、TADをリクルート（動員）するアプローチが採られます。こうした因子を、転写開始点（TSS）の上流にあるプロモーター領域へと誘導するsgRNAと組み合わせることで、遺伝子の発現誘導が可能になります。

CRISPRaには、dCas9-SAM（Synergistic Activation Mediator）[右図モデル図参照（クリックすると拡大されます）]、dCas9-VPR (VP64-p65-Rta) 、SunTagなど、さまざまな手法（モダリティ）が開発されています。これらは、使用するTADやsgRNAの足場（スキャフォールド）の設計といった点で互いに異なります。

また、CRISPRaを予め組み込んだマウスモデルも数多く作出されています。これらのモデルは、マウス初代細胞への複雑なコンストラクトを導入する工程を回避できるため、in vitroおよびin vivoにおけるCRISPRa技術の有用性を大きく高めています。

スクリーニングにおけるCRISPRaの特長と課題

CRISPR技術には全般に、sgRNAライブラリーを利用することで、大規模な遺伝学的スクリーニングを比較的容易に実施できる特長があります。全ゲノムを対象としたCRISPRa用sgRNAライブラリもいくつか公開されています。それぞれに利点と欠点がありますが、CRISPRaスクリーニングの実施は、それ以前から活用されたいたCRISPRノックアウト（CRISPRko）スクリーニングほど単純ではありません。

CRISPRaスクリーニングの難しさは、遺伝子の活性化を実現するにはTSSを正確に標的とする必要があることから来ています。遺伝子のTSSを正確に特定することは困難な場合があり、多くの遺伝子において現在もその特定作業が続けられています 。そのため、効果的なsgRNAを設計することが、CRISPRkoの場合よりもはるかに難しくなっています。さらに、恒久的な変異を誘発するために一度の遺伝子編集のみを必要とするCRISPRkoとは異なり、CRISPRaでは、遺伝子活性化を開始・維持するために、dCas9、TAD、sgRNAを含むCRISPRaシステムの全構成要素を恒常的かつ高レベルで発現させる必要があります。

オーストラリアに中国（兼任）と米国が加わった研究チームは今回、dCas9-SAMシステムをベースにしたマウスCRISPRa全ゲノムsgRNAプラットフォーム「Partita」を開発し、CRISPRaスクリーンの課題を解決しました。

Partitaライブラリの設計と特徴

高密度設計

• 標的遺伝子の活性化確率を高めるため、このライブラリには1つの転写開始点（TSS）あたり10種類のsgRNAを設定。

マルチプロモーター/アイソフォーム対応

• これまでのCRISPRaスクリーニングでは、遺伝子あたり単一のTSSのみを標的としていたため、解析対象は特定のアイソフォーム（TSS）由来の発現に限定。
• RefTSSなどの様々な細胞タイプにわたる高品質なマウスTSSアノテーションのデータセットに基づく新しい手法を用いて、遺伝子あたり最大7つの異なるプロモーターの活性化を実現。

ライブラリーの規模

• 上記２つのアプローチから、21,557遺伝子・26,192箇所のTSSを網羅する260,000以上のsgRNAs（非標的制御用 sgRNAsを含む）の規模のライブラリを構築。

実験目的に合わせた６つのサブライブラリーを用意

[Fig. 1引用下図参照（クリックすると拡大表示されます）]

1. DN​​A修復、エピジェネティクス、GPCR、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、ユビキチン化
2. イオンチャネル、創薬標的、セクレトーム（パート1）
3. セクレトーム（パート2）
4. その他（パート1）
5. その他（パート2）。
6. サブライブラリ1～5の中から転写修飾因子を標的とするsgRNAsを集約したサブライブラリー
   

２つの選択マーカーを採用したベクター構造

ライブラリ全体の有用性を高めるため、そのバックボーンには、利便性を考慮した2つの選択マーカー（ピューロマイシン耐性遺伝子および青色蛍光タンパク質（mTagBFP2）と、最適化済みのsgRNAスキャフォールドが組み込まれています。

実 証 実 験

1. 不死化骨髄由来マクロファージ（iBMDM）での増殖・生存因子スクリーニング（in vitro）
[注] iBMDM（immortalized bone marrow–derived macrophages）

目的とモデル：dCas9-SAM 構成的発現マウスから作成した非がん性のiBMDMに Partita Sublibrary 1 を導入し、通常培養条件下での細胞増殖促進因子（濃縮）および細胞死・増殖抑制因子（枯渇）の同定能力を評価。

実験方法：1 sgRNAあたり500細胞以上のカバー率を維持し、3つの生物学的レプリケートでPuromycin選択直後（T0）、1週間後（T1）、2週間後（T2）、3週間後（T3）のゲノムDNAを次世代シーケンシング（NGS）で解析。

結　果

• 枯渇（Depleted）：アポトーシスや細胞周期停止、細胞老化を誘導する Trp53, Cdkn1a (p21), Casp8, Ripk1 などを標的とするsgRNAが有意に減少。
• 濃縮（Enriched）：アポトーシス抑制・細胞生存を促す Bcl2, Bcl2l1 (BCL-XL) や、p53の負の制御因子 Mdm2 を標的とするsgRNAが有意に増加。
• 個別検証（in vitro）： sgBcl2, sgBcl2l1 導入細胞は増殖優位性を示し、WB解析でタンパク質発現上昇を確認。一方、sgRipk1, sgCdkn1a 導入細胞は速やかに脱落。
• 密度検証（in silico）： 1 TSSあたりのsgRNA数を1〜9個へ削減するダウンサンプリング解析を実施したところ、TSSあたり7個未満になるとヒット一致率（CAT）が50%未満に急落し、高い検出感度と安定性を確保するには 1 TSSあたり10個の高密度設計が不可欠 であることを実証。

2. 「ダブルヒット」びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）における抗がん剤耐性スクリーニング（in vitro）

[注] ダブルヒット・リンパ腫：  がんを促進するMYC遺伝子と、アポトーシスを抑制するBCL2遺伝子という2種類のがん遺伝子に同時に異常（転座など）が起きていて、極めて悪性度が高く薬剤耐性を示すリンパ腫]

• 目的とモデル：マウスDLBCLモデルを用いて、全ゲノムPartitaライブラリによる抗がん剤耐性因子の網羅的探索を実施。
• 対象薬剤：BCL-2阻害薬（ベネトクラクス / venetoclax）、MDM2阻害薬（nutlin-3a）、トポイソメラーゼII阻害薬（エトポシド / etoposide）。
• 結　果：各薬剤に対する既知および新規の耐性遺伝子群が同定され、高い再現性と個別検証率が実証されました。

3. MYC駆動型リンパ腫における悪性化加速因子の同定スクリーニング（in vivo）

• 目的とモデル：MYC過剰発現による pre-B/B細胞リンパ腫モデルを用い、生体内（in vivo）でリンパ腫の発症・進行を加速する因子（オンコジーン）を偏りなく探索。
• 結　果：生体環境下においても、MYCと協調してがん化を促進する重要な制御因子群が新たに同定されました。

結　論

• Partitaは、1 TSSあたり10 sgRNAの高密度標的構造とマルチプロモーター網羅性により、従来法を上回る感度と精度を備えたCRISPRaプラットフォームです。
• がんの依存性解析、薬剤耐性機構の同定、in vivo での病因遺伝子探索に有用なツールであることが実証されました。

crisp_bioメモ：なぜPartita（パルティータ）?

パルティータはWikipedia によると、イタリア語のparte（部分）の複数形partiに由来し、音楽の歴史のなかで、変奏曲（variation）や組曲（suite）に使われてきたそうです。論文にはPartitaと命名された由来は書かれていませんが、「実験の目的に応じた6種類のサブライブラリで構成される26万種類を超えるゲノムワイドsgRNAsライブラリー」を、組曲になぞらえたのでしょう。

参　考

• Science Advances掲載原著論文の著者ら（La Marca, Diepstraten, Kelly, Herold）によるCRISPRaスクリーンをテーマとするレビューが2025年に発表されています：ゲノムを覚醒させる：CRISPRaによるがんの起源と脆弱性の解明. crisp_bio 2025-04-21.； "Awakening the Genome: CRISPR Activation to Unravel the Origin and Vulnerabilities of Cancer"

出　典

"A high-density CRISPR activation platform for mapping cancer dependencies and resistance pathways ex vivo and in vivo" Sarah T. Diepstraten(1,2,8), Yexuan Deng(1,2,3,4,5,8), Margaret A. Potts(1,2,3,4,8), Amy Heidersbach(6,8) [..] Gemma L. Kelly(1,2,9), Jean-Philippe Fortin(7,9), Benjamin Haley,(6,9,10), John E. La Marca(1,2,3,4,9), Marco J. Herold(1,2,3,4,9,10) [+7]. Sci Adv. 2026-09-18. https://doi.org/10.1126/sciadv.aec0722

1. The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Parkville, Melbourne, Australia.
2. Department of Medical Biology, University of Melbourne, Parkville, Melbourne, Australia.
3. Olivia Newton-John Cancer Research Institute, Heidelberg, Melbourne, Australia.
4. School of Cancer Medicine, La Trobe University, Bundoora, Melbourne, Australia.
5. The State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing, China.
6. Department of Molecular Biology, Genentech Inc., South San Francisco, CA, USA. Computational Sciences, Genentech Inc., South San Francisco, CA, USA.
7. Contributed equally
8. Contributed equally
9. Corresponding author