[出典] Nachmanson D, ~ Kennedy SR, Risques RA. “CRISPR-DS: an efficient, low DNA input method for ultra-accurate sequencing” bioRxiv Posted October 21, 2017.
CRISPR-DSとは
- 今回の責任著者の一人でもあるScott R. Kennedyらワシントン大学の研究チームは先行研究（PNAS, 2012）で、次世代シーケンシング（NGS）の一法としてPCRやシーケンシングに由来するエラーを排除して極めて稀な変異を検出可能とする”Duplex Sequencing(DS)”法を開発していた。DSは超高感度であるが、大量のDNAを必要とする弱点があったところ、今回、DSにCRISPR/Cas9を組み合わせて、その弱点を解消し、癌病理解析や法医学解析などに多い微量なDNAからの高感度・高精度なDNA変異判定を可能とした。
CRISPR-DSの手法と従来DSとの比較（下図参照）
- DSの変異検出は極めて高感度であるが、アンプリコンシーケンシングと異なり(*)標的ゲノム領域とプローブとのハイブリダイゼーションにより標的をキャプチャー（ハイブリッドキャプチャー）するプロセスを介することからオンターゲット・リードの比率が5-10%に止まり、大量のDNAサンプルを必要とする。(*) Target Capture for Next Generation Sequencing (NGS)クリニカルシーケンシングの技術開発と実運用を目指して（かずさDNA研究所技術開発部ヒトDNA解析グループ）参照
- 今回、CRISPR/Cas9 による切断とSPRIビーズによる切断されなかったDNAを排除するサイズ選択を経ることで、標的の効率良い濃縮を実現し、DNAサンプルの超音波破砕から始まるDSに対して、時間とコストを大幅に低減した。
CRISPR-DSの実証実験
- TP53のコーディング領域とイントロン領域（上図 a参照) を標的として；DNAフラグメントのサイズを〜500 bpに設定；10-250 ngのDNA量で従来DSと性能比較
- 正常な膀胱組織由来DNA解析：オンターゲットリード率が~5%から>90%へと大きく改善；DNA25ngの解析がDNA250ngの従来DSに相当；短いフラグメントへの偏りが無い・バンド/ピークが明瞭でシーケンシング前にライブラリーの品質判定可能・フラグメントが標的全領域を一様にカバー
- 卵巣癌患者由来腹水由来DNA解析：DNA 100ng（従来DSで必要であったDNA量の30-100分の1）から、従来DSで同定したTP53変異全てを同定
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