[注] 本稿はCRISP_SCIENCEのCRISPR関連2017年11月20日ツイートに準拠しています。
1. 高い特異性を示すeCas9-1.1とCas9-HF1の弱点とその克服
- [出典] Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides. Kim S, Bae T, Hwang J, Kim JS. Genome Biol. 2017 Nov 15;18(1):218.
- ヒト細胞を含む真核細胞でのsgRNAの発現には、転写開始のためにRNA配列の５’末端にグアニン（G）必要とするU6プロモーターが使用することから、sgRNAの5'末端はGに設定される。したがって、標的DNA鎖と１塩基のミスマッチが生じる可能性がある。
- 著者らは今回、Cas9と標的および非標的DNA鎖との非特異的相互作用をアラニン置換によって特異性を高めたeCas9-1.1とCas9-HF1は、ヒト細胞において、sgRNAの5’末端と標的DNA鎖の間にミスマッチが生じるサイトでは、野生型Cas9とは異なり、活性が落ちることを見出した（下図 Fig. 1参照）。 さらに、sgRNAの５’末端に自己開裂するハンマーヘッド（HH）リボザイムを融合しておき、ミスマッチを解消するHH-X20 sgRNAsを生成することで、活性を回復する手法を開発した（下図 Fig. 3 参照）。
2. CRISPys：同一遺伝子ファミリーに属するメンバーの同時多重編集を目指すsgRNAの最適設計
- [出典] CRISPys: Optimal sgRNA design for editing multiple members of a gene family using the CRISPR system. bioRxiv. Posted November 17, 2017. J Mol Biol. 2018 Jul 20;430(15):2184-2195.
- 真核生物の遺伝子の多くはそれぞれの機能が部分的に重複し、一遺伝子のノックアウトが表現型に及ぼす影響が他の遺伝子によって覆い隠される現象がおこる。CRISPR/Cas9がsgRNAに対してミスマッチが存在するDNA鎖も切断可能な特性を生かして、冗長な遺伝子群を一括して編集できる可能性がある。今回、階層的クラスター分析によって得られる冗長な遺伝子群のツリー構造から、一括編集を実現するsgRNAを設計するアルゴリズムを開発し、多重配列アライメントに基づいたMultiTargeterに優ることをトマト（Solanum lycopersicum）の全ての遺伝子ファミリーを対象とするin silico解析で実証
ニワトリ初期胚におけるCRISPR/Cas9機能喪失ゲノム編集を最適化
- [出典] Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Gandhi S, Piacentino ML, Vieceli FM, Bronner ME. Dev Biol. 2017 Dec 1;432(1):86-97. Available online 14 November 2017.
- NLS配列を二重にすることでCas9の核内発現を亢進し、通常のgRNAのA-Uをフリップしヘアピンを伸長したgRNA(“F+E”)(*)を使用することでin vivoでのgRNA転写を亢進し、ニワトリ特異的U6プロモーターを利用；神経堤発生に果たす機能が知られている転写因子Pax7とSox10のノックアウト実験（エレクトロポレーションで導入）で実証
- (*)gRNA (“F+E”)：”Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System” Chen B et al. Cell. 2013 Dec 19;155(7):1479-91.
3. コリネ菌用CRISPR/Cas9ゲノム編集ツールボックスの開発
4. [書籍] CRISPR in Animals and Animal Models- [出典] Development of a CRISPR/Cas9 genome editing toolbox for Corynebacterium glutamicum. Liu J, Wang Y, Lu Y, Zheng P, Sun J, Ma Y. Microb Cell Fact. 2017 Nov 16;16(1):205.
- CRISPR/Cas9をコリネ菌に最適化；遺伝子の欠損と挿入の効率それぞれ30.8–60.0%と16.7–62.5%、ssDNAを介したリコンビアニングによる一塩基改変を含む小規模改変の効率80.0%、２遺伝子座の編集効率40.0%を達成
- Progress in Molecular Biology and Translational Science Volume 152, Pages 1-138 (2017) . Edited by Raúl Torres-Ruiz and Sandra Rodriguez-Perales. Hardcover ISBN: 9780128125069
- Chapter 1 - CRISPR History: Discovery, Characterization, and Prosperity. p.1-21
- Chapter 2 - CRISPR/Cas9 Technology: Applications and Human Disease Modeling p.23-48
- Chapter 3 - Dynamics of Indel Profiles Induced by Various CRISPR/Cas9 Delivery Methods. p.49-67
- Chapter 4 - CRISPR Libraries and Screening Pages. p.69-82
- Chapter 5 - Genome Engineering Using Haploid Embryonic Stem Cells Pages. p.83-94
- Chapter 6 - CRISPR in Animals and Animal Models Pages. p.95-114
- Chapter 6 - Gene Editing and CRISPR Therapeutics: Strategies Taught by Cell and Gene Therapy. p.115-130
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