Trim-Away: 任意の細胞で任意のタンパク質を直接かつ迅速に分解する : crisp

[2019-09-27 crisp_bio追記] Nature Protocols投稿："Acute and rapid degradation of endogenous proteins by Trim-Away" Clift D, So C, McEwan WA, James LC, Schuh M. Nat Protoc. 2018 Sep 24.
[出典] "A Method for the Acute and Rapid Degradation of Endogenous Proteins." Clift D, McEwan WA, Labzin LI, Konieczny V, Mogessie B, James LC, Schuh M. Cell. 2017 Nov 13.

細胞内のタンパク質の量は、mRNAレベルで調節されるのか、タンパク質の合成・分解レベルで調節されるのか、それが問題だ（crisp_bioブログ記事から引用）

DNAノックアウトとRNAiによってゲノムレベルとmRNAレベルでタンパク質を間接的にノックアウトあるいはノックダウンすることが可能になったが、細胞内で内在タンパク質を直接分解する手法は実現されていなかった。英国MRCとドイツMPIの研究チームは今回、哺乳類細胞内のタンパク質をタンパク質の修飾や改変をすることなく、直接かつ数分で分解可能とする手法、Trim-Away、を実現した。

病原体分解を媒介する細胞内抗体受容体TRIM21を再利用する

今回の著者でもあるW. A. McEwanやL. C. Jamesらが発見したTRIM21は、E3ユビキチンリガーゼの一種であり、多様な細胞と組織に広く存在している。TRIM21は、病原体に結合した細胞内抗体のFcドメインに高い親和性で結合し、ユビキチン・プロテアソーム系をリクルートして、抗体が結合した病原体（RNA/DNAウイルス、バクテリア）およびミスフォールディング・タウ（PNAS, 2017）を分解する。

３ステップでTrim-Away

外来TRIM21を導入
解析対象とするタンパク質（protein of interest；PoI）に対する抗体を導入
TRIM21による抗体結合PoIのユビキチン化とそれに続く分解

GFPをPoIのモデルとする検証

mCherry-TRIM21を過剰発現させたNIH 3T3に、フリーなGFPと抗-GFP抗体をマイクロインジェクションし、想定通りの機序でGFPが急速に分解されること（半減期16分）を確認
NIH 3T3細胞での実験と同じくGFPをPoIとしてタンパク質分解を確認：有糸分裂後の初代細胞（転写が起こっていないマウス卵母細胞）にて
フリーなGFPに加えて、細胞膜結合GFP、ヒストンH2B結合GFPおよびNLS結合GFPのいずれも迅速分解；抗体のFcドメインを融合したナノ粒子をTRIM21と共発現させることで、H2B-GFPの核内分解も実現

内在性タンパク質での検証

マウス卵母細胞内Eg5をPoIとして、Eg5タンパク質分解と、Eg5-mEGFPをコードするmRNAのマイクロインジェクションでのレスキュー実験によるTrim-Awayの特異性を確認
減数分裂時の染色体分配に関与するコヒーシンサブユニットRec8をPoIとして、Trim-Awayが寿命が長いタンパク質も迅速に分解することを確認（半減期〜11分）
正常および変異ハンチントン・タンパク質をNIH 3T3細胞で共発現し、変異タンパク質特異的抗体を採用したTrim-Awayにより、正常タンパク質を損なうことなく、変異タンパク質を選択的に分解できることを確認

エレクトロポレーションにより細胞集団への展開を実現

TRIM21を過剰発現させたNIH 3T3細胞とHEK293細胞に、ERK1とIKKαを標的とする抗体をエレクトロポレーション後1〜２時間で標的タンパク質が分解し3~4日間欠損が維持され、抗体の消耗とともに、標的タンパク質が回復
中心体タンパク質ペリセントリンやm-TORなどについてもタンパク質欠損が表現型に与える影響を分析可能なことを確認
Trim-Awayは、あらかじめTRIM21を過剰発現させておくことなく、抗体と同時にTRIM21タンパク質を細胞へエレクトロポレーションすることでも有効なことを確認

初代細胞でのタンパク質分解