１．CRISPR/Cas編集結果の簡易なハイスループット・スクリーニングを、既存のNGSライブラリー構築キットに簡明なWebツールを組合わせたプラットフォームを実現し、イネとヒト細胞で性能を実証
- [出典]"Hi-TOM: a platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems" Liu Q, Wang C, Jiao X, Zhang H, Song L, Li Y, Gao C, Wang K. bioRxiv Posted Decmber 18, 2017.
- [Webサイト] Hi-TOM: High-throughput Tracking Of Mutations
２．CRISPR技術による遺伝子編集にあたり、APOBEC3が誘導する変異スペクトラム
- [出典]"APOBEC3 induces mutations during repair of CRISPR–Cas9-generated DNA breaks" Lei L, ~ Shen B, Yang L, Chen J. Nat Struct Mol Biol 2017 Dec 11
- C-to-T変換を実現する塩基エディター (BE3)に組み込まれているシチジンデミアーゼ (APOBEC-AID)ファミリーは、ssDNAのCをUに変換する。南京医科大学、上海生物科学研究所および上海工科大学の研究チームは今回、CRISPR-Cas9によるゲノム編集においてAPOBECが誘導する変異スペクトルを明らかにした。
- APOBECは、ssODNsに対してはC-U変換を誘起するが、dsODNsに対してはC-U変換を誘起しない（Fig.1-a）。
- Cas9-sgrRNAと修復用テンプレートssODNによる相同組換え修復（HDR）時には、修復用テンプレートのssODNに対してC-U変換を誘起し、その変異が修復後のゲノムDNAに取り込まれ、結果的に、ゲノムDNAへと塩基置換が継承される（Fig.2-a）。
- BE3のベースであるCas9n (D10A; H840A)が誘導するssDNA（標的鎖と非標的鎖）に対してAPOBEC3がC-U変換を誘起し、その結果、ゲノムDNAの切断箇所の近傍にindels変異が発生する (下図 Fig 3-a)。
- 前述のindels変異は、APOBEC3が、Cas9n（D10A）によるゲノム編集、または、Cas9nをベースとするBE3による一塩基編集時に生成されるssDNAにC-U変換を誘起するのに続いて、ゲノムDNA内のウラシルに対して、内在する酵素群による塩基除去修復機構によって発生するDSBがNHEJにより修復される際に、発生する (Fig 4-a)。
- HDRの修復用テンプレートとしてssODNに替えてdsODNを利用し、または、塩基除去修復機構に関わる酵素（UNG阻害；DNA グリコシラーゼ阻害）を抑制することで、望ましくないゲノムDNA変異を抑制することができる。
３．バクテリオファージDNAの核酸塩基修飾に対抗する原核生物のCRISPR-Casシステム多様化
- [出典]"Bacteriophage DNA glucosylation impairs target DNA binding by type I and II but not by type V CRISPR–Cas effector complexes" Vlot M, Houkes J, Lochs SJA, Swarts DC, Zheng P, Kunne T, Mohanraju P, Anders C, Jinek M, van der Oost J, Dickman MJ, Brouns SJJ. Nucleic Acids Res. 2017 Dec 14.
- 原核生物は、侵入DNAに配列特異的に結合する制限修飾系（R-M）とCRISPR-Casの防御システムによって、侵入DNAに対抗する。一方で、T-evenファージは核酸塩基の共有結合修飾を介して、宿主防御システムのDNAへの結合、ひいてはDNA切断、を回避する。Stan J.J. Brouns（ヴァーヘニンゲン大学）らは今回、T4ファージのDNAにおける5-ヒドロキシメチルシトシンのグルコシル化によるCRISPR-Casシステムからの回避が、CRISPR-Casシステムのタイプに依存することを見出した。
- タイプI-EとタイプⅡ-Aに対しては、それぞれCascadeとCas9-cfRNA複合体に対するT-4ファージDNAの親和性が下がることで、認識・切断を回避
- タイプV-AのCas12a（Cpf1）に対しては、Cpf1のよりオープンな構造ゆえと思われるが、回避できず
４．ヤギ卵母細胞へCRISPR/Cas9をマイクロインジェクションすることで、膵臓発生を阻害
- [出典]"CRISPR/Cas9 microinjection in oocytes disables pancreas development in sheep" Vilarino M, Rashid ST, Suchy FP, McNabb BR, van der Meulen T, Fine EJ, Ahsan S, Mursaliyev N, Sebastiano V, Diab SS, Huising MO, Nakauchi H, Ross PJ. Sci Rep. 2017 Dec 12;7(1):17472.
- 再生医療の究極は、多能性幹細胞（PSCs）から患者に適合する器官の生成にあり、臓器欠損ヤギの胚盤胞補完法によるヒト器官生成が有望な手法の一つである。UC DavisのPablo J. Rossとスタンフォード大学の中内啓光らの研究チームは今回、膵臓発生の鍵となる遺伝子であるPDX1を標的とするCRISPR/Cas9システムを卵母細胞へマイクロインジェクションすることで、膵臓欠損ヤギを作出した。
- 第二分裂中期（MⅡ）でのインジェクションは、接合糸期でのインジェクションよりも、溶解が低減され、胚盤胞形成率が高く、PDX1両アレル変異率が高く、モザイク発生は同程度、であった（Figure 1 参照）。
- さらに、PDX1遺伝子のエクソン１の２箇所を標的とする二重sgRNAsを利用することで、PDX1のノックアウトを実現した（Figure 4 参照; 1箇所を標的とするsgRNAを利用した場合は、膵臓が発生する場合がある）。
５．セイヨウアブラナ(Brassica napus）黒脚病菌Leptosphaeria maculansを利用して、遺伝子破壊技術の最適化を図る
- [出典]"Spontaneous and CRISPR/Cas9-induced mutation of the osmosensor histidine kinase of the canola pathogen Leptosphaeria maculans" Idnurm A, Urquhart AS, Vummadi DR, Chang S, Van de Wouw AP, López-Ruiz FJ. Fungal Biol Biotechnol. 16 December 2017
- L. maculansは、ジカルボキシイミド殺菌剤イプロジオンに対して、hos1遺伝子変異によって耐性を獲得する。また、他の菌類と異なり、hos1遺伝子を欠損しても塩濃度では低成長になるが、B. bapusに感染可能である。したがって、イプロジオンによるスクリーニングが可能であり、今回、L. maculansのゲノム編集へのCRISPR/Cas9の最適化を図り、hos1遺伝子以外に24種類の遺伝子編集を実現した。
６．[プロトコル]CRISPR/Cas9により、糖原病Ⅲ型モデルとなるGDEヘテロ型変異を帯びたヒトES細胞株WAe001-A-14を作出
- [出典]"Generation of a GDE heterozygous mutation human embryonic stem cell line WAe001-A-14 by CRISPR/Cas9 editing" Xu G, ~ Chen Y. Stem Cell Res 2017 Dec 13.
７．[レビュー]メディシナルケミストリーとケミカルバイオロジーにおけるCRISPR-Cas技術の応用およびゲノム編集に関する法的・倫理に関する議論の動向
- [出典]"CRISPR-Cas in Medicinal Chemistry. Applications and Regulatory Concerns" Duardo-Sanchez A. Curr Top Med Chem. 2017 Dec 11.
８．[特許]造血幹細胞のゲノム編集を目的とするCRISPRシステムと構成因子の送達、利用および治療応用
- [出典]DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF CRISPR SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR GENOME EDITING AS TO HEMATOPOIETIC STEM CELLS (HSCs) US Application 2017/0349914 A1
- 発明者 David Benjamin Turitz Cox, James E Dahlman, Feng Zhang；権利者 Broad Inst.; MIT；公開日 12/07/2017
９．[特許]N末端側とC末端側に分割したCas9をそれぞれ２つのベクターで送達するゲノム編集
- [出典]GENOME EDITING WITH SPLIT CAS9 EXPRESSED FROM TWO VECTORS US Patent Application 2017/0349905 A1
- 発明者 Jin Soo Kim, Tae Young Koo；権利者 Institute for Basic Science (Daejeon, KR) ；公開日12/07/2017
10．[特許]DNA/RNAハイブリッド・ポリヌクレオチドを利用するクラス２ CRISPRシステム
- [出典]"CRISPR HYBRID DNA/RNA POLYNUCLEOTIDES AND METHODS OF USE" US Application 2017/0349915 A1
- 発明者 Andrew Paul May, Paul Danie Donohoue；権利者 Pioneer Hi-Bred International Inc.；公開日12/07/2017
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