9.GPCRとCRISPR-dCasの共役により、細胞シグナル受容・変換器を人工合成
  • [出典]"Engineering cell sensing and responses using a GPCR-coupled CRISPR-Cas system" Kipniss NH, Dingal PCDP, Abbott TR, Gao Y, Wang H, Dominguez AA, Labanieh L, Qi LS. Nat Commun. 2017 Dec 20;8(1):2212. (bioRxiv Posted June 20, 2017)
  • GPCRsは、真核生物の膜受容体の中で、最大かつもっとも多様であり、ヒトの体内で広範なシグナルを検知する。Lei S. Qi(Stanford U)らは、GPCRが検知する細胞外の天然および合成シグナルに応じて、CRISPR-dCas9を介して細胞内での遺伝子発現を調節する分子デバイスを構築した。
  • これまでに、GPCRと転写因子を融合した分子デバイスがTango(transcriptional activation following arrestin translocation)と命名された手法によって開発・展開されてきたが、今回は、Tango方式(Fig.1-a 左)に加えて、あらたにCha Cha方式(Fig.1-b 右)を開発し、Cha Cha方式が優れていることを示した。
Engineering cell sensing and responses using a GPCR 1
  • 数理モデルから、Cha Cha方式では、GPCRの活性状態において多重なdCas9をGPCRから遊離・核移行させることが可能;Cha Cha方式は用量(リガンド濃度)依存で可逆的であり、GPCRを介した細胞外リガンドからのキューに応じて内在遺伝子の多重同時活性化が可能(Fig. 3 参照);細胞外シグナルとして、合成化合物、ケモカイン、分裂促進因子、脂肪酸、およびホルモン/GPCRsとして、合成GPCRs(本研究で主として対象とされたヒトM3D;KORD)および天然GPCRs(LPAR, CXCR4, NMBR, ADRB2, AVPR, TRHR)の8種類で実証(Fig.4 参照)
  Engineering cell sensing and responses using a GPCR 2 Engineering cell sensing and responses using a GPCR 3
  • 関連論文とブログ記事
  1. "The genetic design of signaling cascades to record receptor activation" Barnea G, Strapps W, Herrada G, Berman Y, Ong J, Kloss B, Axel R, Lee KJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jan 8;105(1):64-9. Epub 2007 Dec 28.
  2. "合成Notch受容体によるシグナル伝達経路の設計と腫瘍免疫療法への展開" ブログ記事 2017/10/02(2016/03/05)
  3. "PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome" Kroeze WK, Sassano MF, Huang XP, Lansu K, McCorvy JD, Giguère PM, Sciaky N, Roth BL. Nat Struct Mol Biol. 2015 May;22(5):362-9. Epub 2015 Apr 20.
  4. "Engineering Synthetic Signaling Pathways with Programmable dCas9-Based Chimeric Receptors" Baeumler TA, Ahmed AA, Fulga TA.Cell Rep. 2017 Sep 12;20(11):2639-2653
10.CRISPR/Cas9による標的DNAの切断から始める新たな等温遺伝子増幅法を開発
  • [出典]"CRISPR/Cas9 triggered isothermal amplification for site-specific nucleic acid detection" Huang M, Zhou X, Wang H, Xing D. Anal Chem. 2017 Dec 20.
  • "CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction"からCAS-EXPARと命名;CRISPR/Cas9で生成されたDNA断片を、外来プライマー不要でサイクル増幅し、リアルタイムで蛍光モニタリング;検出限界0.82 a-molを達成し、1塩基ミスマッチを識別;DNAメチル化とリステリア・モノサイトゲネス (L. monocytogenes) の全RNAの検出で実証
11.ロドプシン(RHO)変異アレルを標的とするCas9/sgRNAをAAV9.PHP.Bで硝子体内注射することで網膜色素変性治療
  • [出典]"Cas9/sgRNA selective targeting of the P23H Rhodopsin mutant allele for treating Retinitis Pigmentosa by intravitreal AAV9.PHP.B-based delivery" Giannelli SG, ~ Broccoli V. Hum Mol Genet. 2017 Dec 21.
  • RHO遺伝子の野生型アレルを維持し、P23H変異アレルを選択的に不活性化することで、網膜色素変性モデルマウス(ヘテロ型Rho変異体)の光受容器変性を遅らせ、網膜の機能を改善;ホモ型P23H変異を帯びたヒト細胞株でも実証
12.二本鎖DNA切断を経ない精密かつ高効率な遺伝子編集の新たな手法
  • [出典]"Precise and efficient nucleotide substitution near genomic nick via noncanonical homology-directed repair" Nakajima K, Zhou Y, Tomita A, Hirade Y, Gurumurthy CB, Nakada S. Genome Res. 2017 Dec 22.
  • 標的遺伝子の1箇所に加えて、相同組換え修復テンプレートのドナープラスミドの1箇所にも、Cas9(D10A)ニッカーゼによってニックを入れる"Single Nicks in the reporter Gene and backbone of the Donor plasmid"(SNGD)ことで、塩基置換効率の大幅向上とindelsの大幅低減を実現(Figure 2 参照);SNGDによるヒト細胞株内在遺伝子の編集も確認;SNGDによる遺伝子編集には、標的遺伝子と修復テンプレートとの間の長い相同配列が必要であるが、DNA修復に関連する酵素(CtIP, RAD51またはRAD52)を必要としなかったことから、SNGDでは、非古典的相同組換えに依存することが示唆された。
Precise and efficient nucleotide substitution
13.多孔性材 Zeolitic Imidazolate framework (ZIF)によって、CRISPR/Cas9システムのエンドソームエスケープを介した細胞質移行を実現
  • [出典]"Endosomal Escape and Delivery of CRISPR/Cas9 Genome Editing Machinery Enabled by Nanoscale Zeolitic Imidazolate Framework" Alsaiari SK, Patil S, Alyami M, Alamoudi K, Aleisa F, Merzaban J, Li M, Khashab NM. J Am Chem Soc. 2017 Dec 22.
  • CRISPR/Cas9をナノスケールのZIF-8に内包させ(CC-ZIF)、プロトン化イミダゾール基によるエンドソム・エスケープ促進を利して、CRISPR/Cas9によりGFP遺伝子発現を37%ノックダウンを実現。
14.分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)のクローン・フリーなCRISPR/Cas9によるゲノム編集
  • [出典]"A cloning-free method for CRISPR/Cas9-mediated genome editing in fission yeast" Xiao-Ran Zhang, Jia-Bei He, Yi-Zheng Wang,  Li-Lin Du. bioRxiv. Posted December 26, 2017.
  • CRISPR/Cas9によるS. pombeのゲノム編集において、sgRNA配列のプラスミドへの組込みがボトルネックになっていた。今回、分裂酵母に内在するgap-repair cloning機構を利用して、クローニングを必要としないCas9-sgRNA環状プラスミド形成法を確立した(Figure 1参照)。この前処理によって、効率的な点変異ノックイン、N末端タギングおよびゲノム配列削除を実現。
A cloning-free method for CRISPR-Cas9-mediated

15.[レビュー]CRISPR技術による低分子標的の同定
  • [出典]"CRISPR approaches to small molecule target identification" Jost M, Weissman JS. ACS Chem Biol. 2017 Dec 20.
  • CRISPR技術による遺伝子編集が薬剤感受性に与える影響を見ていく手法を中心として、薬剤標的の化学遺伝学的同定法を概観
16.[レビュー]AAV-CRISPRシステムを利用したin vivo動物ゲノム編集 - ヒト疾患の臨床研究への展開
  • [出典]"In vivo genome editing in animals using AAV-CRISPR system: applications to translational research of human disease" Liu CH, Smh Y. F1000Research. Last updated 20 DEC 2017.
  • AAVで送達するCRISPR/Cas9ゲノム編集技術の進歩をレビューし、オフターゲット作用、免疫原性および毒性を回避する法を議論;ウイルスを使用しないex vivo遺伝子治療についても議論