CRISPRメモ_2018/01/25（SAMによるKlotho活性化；L. lactis発現システム；スクリーニング２件；CRISPR編集結果評価法２件） : crisp

１．CRISPRa（CRISPR-dCas9・SAM）によりアンチエイジングと認知機能向上の遺伝子Klothoを活性化

[出典] Chen CD, Zeldich E, Li Y, Yuste A, Abraham CR. "Activation of the Anti-Aging and Cognition-Enhancing Gene Klotho by CRISPR-dCas9 Transcriptional Effector Complex" J Mol Neurosci. 2018 Jan 19.

Klothoは、神経細胞生存を助長し、酸化ストレス耐性を増し、脱髄した軸索の再ミエリン化を促進する。ボストン大学の研究チームは今回、CRISPRaシステムにより、Klothoのプロモーター領域（-1 bp 〜 -300 bp）を標的とするsgRNAsからKlothoを、mRNAレベルでもタンパク質レベルでも、転写活性化する2種類のsgRNAsを同定。転写活性化のアッセイ法として、CRISPR技術でKlotho 3'-UTRにノックインしたNLucルシフェラーゼも利用。

２．Lactococcus lactisにおけるタンパク質発現誘導システムの拡張

[出典] Berlec A, Škrlec K, Kocjan J, Olenic M, Štrukelj B. "Single plasmid systems for inducible dual protein expression and for CRISPR-Cas9/CRISPRi gene regulation in lactic acid bacterium Lactococcus lactis" Sci Rep. 2018 Jan 17;8(1):1009.

L. lactisは、食品グレードの乳酸菌であり、食品産業における細胞工場とタンパク質発現ホストとして活用されている。L. lactisにおけるタンパク質発現にはnisin(ナイシン)-controlled inducible expression（NICE）法が利用されているが、新たな発現誘導ツールが必要である。
スロベニアのJožef Stefan研究所とLjubljana大学の研究チームは今回、ナイシン・プロモーターの二重化とマルチプルクローニングサイト（MSCs）を組み込むことで、、NICEを2種類のタンパク質同時発現へと拡張するプラスミド（pNZDual; pNZDualTT; pNZPolycist）を開発した。
さらに、pnZDualを改変して、sgRNAの発現誘導とCas9（またはdCas9）の発現を可能とする単一プラスミドpNZCRISPR（pNZCRISPRi）を開発し、CRISPR切断による遺伝子の不活性化またはCRISPRiによるサイレンシングを実現した。

３．[プロトコル]CRES-Seq：CRISPR-Cas9による編集が起こったクローンを効率良くハイスループットで選別する法

[出典] Veeranagouda Y, Debono-Lagneaux D, Fournet H, Thill G, Didier M （Sanofi R&D）. "CRISPR-Cas9-Edited Site Sequencing (CRES-Seq): An Efficient and High-Throughput Method for the Selection of CRISPR-Cas9-Edited Clones" Curr Protoc Mol Biol. 2018 Jan 16;121:31.14.1-31.14.11.

CRES-Seq = CRISPR-Cas9 Edited Site (CRES) Sequencing；１回のMiniSeq (Illumina)ランで、96箇所までのCRESの精密なジェノタイピングを、$6/cloneのコストで可能。

４．Wntシグナルに依存する非対称細胞分裂において局所的に作用するタンパク質を、CRISPRタギングによりスクリーン

[出典] Heppert JK, Pani AM, Roberts AM, Dickinson DJ, Goldstein B. "A CRISPR Tagging-Based Screen Reveals Localized Players in Wnt-Directed Asymmetric Cell Division" Genetics. 2018 Jan 18.

非対称細胞分裂のシグナル伝達に関わるタンパク質を、候補タンパク質のノックアウトや過剰発現をすることなく、CRISPRで標識し細胞内での動態を観察。
線虫において23種類の候補タンパク質の細胞内局在を4細胞期胚で観察し、DishevelledとAPCのホモログがWntシグナルに応じた指向性細胞分裂に関与することを見出した。

５．CRISPR-Cas9編集活性の評価法を比較する

[出典] Sentmanat MF, Peters ST, Florian CP, Connelly JP, Pruett-Miller SM. "A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing" Sci Rep. 2018 Jan 17;8(1):888.

T7E1エンドヌクレアーゼ1によるミスマッチアッセイ（T7E1）、標的次世代シーケンシング（NGS）、Tracking of Indels by Decomposition (TIDE（文献；Webサイト）)およびIndel Detection by Amplicon Analysis (IDAA) を比較し、NGSが最適なツールと判定
T7E1は精度が低く、TIDEとIDAAは、一細胞由来のクローン群の解析において、NGSよりもミスコールが高頻度。

６．CRISPR/Cas9による変異導入の多重化可能な評価法

[出典] Zhang H, Zhou Y, Wang Y, Zhao Y, Qiu Y, Zhang X, Yue D, Zhou Z, Wei W. "A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis" Sci Rep. 2018 Jan 18;8(1):1042.

CRISPR/Cas9編集効率の評価法として、北京大学の研究チームはUDAR (Universal Donor As Reporter)法を開発；レポータータンパク質EGFPをCRISPR/Cas9を介したNHEJで標的部位にノックイン
T7E1アッセイ法とSurveyorアッセイ法が最もよく利用されているが、作業量と経費を要し、多数のサンプルの同時評価に向いていない問題点を、UDARが解決（下図参照）。