CRISPRメモ_2018/02/05（CRISPR-i/ko+scRNA-seq、ハンチントン、カイコNPV、エピトープタギング、スーパーエンハンサー、siRNA比較、NgAgo比較） : crisp

１．CRISPR/Cas9遺伝子編集結果を単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)で読み出す手法一覧

[出典] Hill AJ, ~ Shendure J, Trapnell C. "On the design of CRISPR-based single cell molecular screens" Nat Methdos 2018 Apr;15(4):271-274. Online 2018-02-19 (bioRxiv. Posted January 29, 2018. )
CRISPR/Cas9-scRNA-seqに必要な細胞バーコーディングには、gRNAにバーコード配列をcis配置する手法（Perturb-seq; CRISP-seq; Mosaic-Seq ）と、レンチウイルスのLTRにもsgRNAを配置することでsgRNA自身をscRNA-seqで検出可能にする手法（Drop-seq）が工夫されている。著者らは前者の場合、レンチウイルス調整の際にsgRNAとバーコードの対応関係が〜50%スワップすることを見出した。そこで、DROP-seqを改良することで、sgRNAの細胞への対応付け効率を94%まで高めた。

[関連crisp_bio記事]

[CRISPR/Cas9-scRNA-seq文献リスト]

Perturb-seq：Dixit A et al. "Perturb-Seq: Dissecting Molecular Circuits with Scalable Single-Cell RNA Profiling of Pooled Genetic Screens" Cell. 2016 Dec 15;167(7):1853-1866.e17.；Adamson B et al. "A Multiplexed Single-Cell CRISPR Screening Platform Enables Systematic Dissection of the Unfolded Protein Response." Cell. 2016 Dec 15;167(7):1867-1882.e21.
CRISP-seq：Jaitin DA et al. "Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq" Cell. 2016 Dec 15;167(7):1883-1896.e15.
Mosaic-Seq：Xie, S., Duan, J., Li, B., Zhou, P. & Hon, G. C. "Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells" Mol Cell. 2017 Apr 20;66(2):285-299.e5. Published online 2017 Apr 13.
CROP-seq：Datlinger P et al."Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome readout"　Nat Methods. 2017 Mar;14(3):297-301. Published online 2017 Jan 18.（下図は、Webサイトの画面キャプチャ 2018/02/04 18:00）

２．Cas9ニッカーゼによりハンチントン遺伝子（HTT）からCAGリピートを精密削除

[出典] Dabrowska M, Juzwa W, Krzyzosiak WJ, Olejniczak M. "Precise excision of the CAG tract from the huntingtin gene by Cas9 nickases" Front Neurosci. Accepted 2018 Jan 29.
CAGリピート数がさまざまなハンチントン病患者由来の線維芽細胞において、一対のCas9ニッカーゼにより、HTTを不活性化し、CAGリピート数によらずハンチンチン・タンパク質合成を阻害。本手法は他のポリグルタミン病に適用可能

３．CRISPR/Cas9システムによるカイコ(Bombyx mori)核多角体病ウイルス(NPV)の排除

[出典] Dong Z, Dong F, Yu X, Huang L, Jiang Y, Hu Z, Chen P, Lu C, Pan M. "Excision of Nucleopolyhedrovirus form Transgenic Silkworm using the CRISPR/Cas9 System" Front Microbiol. Accepted 2018 Jan 30.
BmNPVの最初期遺伝子（immediate early gene-1: ie-1）を標的とするCRISPR/Cas9-sgRNAを発現するトランスジェニック・カイコを作出し、BmNPVゲノムの標的サイトの編集を実現し、BmNPV感染後の大規模な欠失を確認; 顆粒体接種に対するLD50が野生型カイコの1,000倍に。

４．マウス幹細胞における効率的かつスケーラブルなエピトープ・タギングを可能にしたCas9 RNPによるパイプライン

[出典] Dewari PS, ~ Pollard SM. "An efficient and scalable pipeline for epitope tagging in mammalian stem cells using Cas9 ribonucleoprotein" bioRxiv. Posted January 29, 2018.
Cas9と予めアニーリングした36-mer crRNAと67-mer tracrRNAで形成されたRNPを、修復テンプレートとなるssODNとともにエレクトロポレーションすることで（下図左 Fgiure 1）、マウスのES細胞、神経細胞、および脳腫瘍由来幹細胞において、セレクションを掛けることなく、〜5〜３０％のノックイン効率を達成

５．CRISPR遺伝子編集技術により、腫瘍抑制遺伝子Klf6関連スーパーエンハンサー(SE)を、ヒト肝癌由来HepG2細胞株にて同定

[出典] Ri KC, Kim JS, Kim Chol. "Identification of Klf6-Related Super Enhancer in Human Hepatoma (HepG2) Cells by CRISPR Technique" Genet Mol Res. 2017 Nov 29;16(4):gmr16039841
Super Enhancer Archive(SEA,http://sea.edbc.org)から入手したデータをもとに、HepG2におけるSEを標的とするCRISPR/Cas9により、領域削除の効果を判定；Klf6-SEの階層構造とSEを構成する個々のエンハンサーの機能を同定し、Klf6-SEがKlf6の発現の80%を担うことを明らかにした。

６．遺伝子機能解析には、siRNA KD（ノックダウン）よりもCRISPR/Cas9 KO（ノックアウト）が適している

[出典] Wang F, ~ Xing X, Wang Q. "A comparison of CRISPR/Cas9 and siRNA-mediated ALDH2 gene silencing in human cell lines"Mol Genet Genomics. 2018 Jan 30.
ヒト肝癌由来HepG2細胞株とHEK293FT細胞にて、CRISPR/Cas9 KO細胞ではmRNAの発現が顕著に低減し、タンパク質の発現が検出されなくなり、ALDH2の機能も失われたが、siRNA KDはそのような状態には至らなかった。

７．CRISPR/Cas9によるゼブラフィッシュの胚性遅筋をモデルとしたサルコメア発生に関わる迅速遺伝子機能解析とNgAgoによる遺伝子編集の検証

[出典] Cai M, Si Y, Zhang J, Tian Z, Du S. "Zebrafish Embryonic Slow Muscle Is a Rapid System for Genetic Analysis of Sarcomere Organization by CRISPR/Cas9, but Not NgAgo" Mar Biotechnol. 2018 Jan 27.
myomesin-3-RFPと2種類の内在遺伝子（slow myosin heavy chain-1 (smyhc1) とheat shock protein 90 α1 (hsp90α1)）を標的とする実験；CRISPR/Cas9は有効、NgAgoによる遺伝子編集は見られず

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