1.MhAX (microhomology assisted excision):マイクロホモロジー媒介末端結合 (MMEJ)を介したヒトiPSCsのスカーレス・ゲノム編集
  • "Microhomology-assisted scarless genome editing in human iPSCs" Kim S, ~ Woltjen K. Nat Commun. 9, Article number: 939. 2018 Mar 5.
  • MMEJは、Kuタンパク質に依存して、二本鎖DNA切断 (DSB)の左右に自然に発生する5-25 bpのマイクロホモロジー (μH)を介して末端を結合する機構である。MMEJの結果、μH間の配列は再現性良く削除され、μH1コピーが維持される。
  • CiRA、慶應大学および広島大学の研究チームは今回、通常設計される点変異と正の選択用マーカーからなるDSB修復用ベクターにおいて、マーカーの左右を標準化したCRISPR-Cas9プロトスペーサを挟んで合成μHで囲み、遺伝子編集後の正の選択後にMMEHを誘導することで、目的の点変異だけを残して選択用マーカを外来遺伝子を残すことなく削除する手法、MhAX、を開発した。
  • MhAXにより、マーカーの左右に正常塩基と変異塩基を帯びたμHを配置することで('不完全な’μHを介して)、正常遺伝子、ヘテロ型変異遺伝子、ホモ型変異遺伝子をそれぞれ帯びた3種類の細胞を作出した。
  • 実証実験として、先天性プリン代謝異常症に関連するHPRT1遺伝子とAPRT遺伝子 (下図参照)を帯びた細胞を作出した。
MhAX
2.CRISPR-Cas9によりSaccharomyces cerevisiaeのrRNA150リピート全てのSSU内標的サイトに同時に継代可能な点変異またはイントロン導入を実現
  • "A method for simultaneous targeted mutagenesis of all nuclear rDNA repeats in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas9" Chiou L, Armaleo D. bioRxiv. Posted March 4, 2018.
3.レジオネラ症をもたらすLegionella pneumophilaのタイプI CRISPR-Casシステム
  • "Working together: cross-priming in two Legionella pneumophila type I-F CRISPR-Cas systems" Deecker SR, Ensminger AW. bioRxiv. Posted March 4, 2018.
  • タイプI CRISPR-Casシステムのスペーサー獲得にはnaïve型とprimed型の2種類 (新規侵入DNAと既知の侵入DNA)が存在;L. pneumophila str. Lensに存在する2種類のタイプI-F CRISPR-Casシステムが、スペーサーが大量に失われた際に、クロストーク(cross-priming)して、スペーサーを互いに補充
4.Campylobacter jejuni Cas9は、RNAを介して内在RNAsに結合し切断する
  • "CRISPR RNA-Dependent Binding and Cleavage of Endogenous RNAs by the Campylobacter jejuni Cas9" Dugar G, Leenay RT, Eisenbart S1, Bischler T, Aul BU, Beisel CL, Sharma CM. Mol Cell. 2018 Mar 1;69(5):893-905.e7.
  • CjCas9は、crRNAとtracrRNAに依存してRNAに結合し、HNHドメインを介してRNAを切断する
  • RNA結合タンパク質免疫沈降とRNA-seqを組み合わせたRIP-seqにより、多くの内在RNAがCjCas9と共免疫沈降し、その一部がCjCas9のHNHドメインにより切断された。CjCas9のRNA切断はsgRNAでプログラム可能
5.髄膜炎菌Neisseria meningitidisのタイプII-C CRISPR-Cas9は、プログラム可能なリボヌクレアーゼである
  • "Programmable RNA Cleavage and Recognition by a Natural CRISPR-Cas9 System from Neisseria meningitidis" Rousseau BA, Hou Z, Gramelspacher MJ, Zhang Y. Rousseau BA,~ Zhang Y. Mol Cell. 2018 Mar 1;69(5):906-914.e4. Available online 2018 Feb 15.
  • NmeCas9はcrRNAにガイドされPAMに依存することなくssRNAを部位特異的に認識・切断;また、ヌクレアーゼ活性を欠損させたdNmeCas9もssRNA標的を認識;NmeCas9の活性は、3種類の抗タイプII-C CRISPRタンパク質 (AcrIIC3NmeAcrIIC3NmeAcrIIC3Nme)によって阻害される。
6.[レビュー]CRISPR技術に拠るノンコーディング・ゲノムのハイスループット・アノテーション
  • "CRISPR-based methods for high-throughput annotation of regulatory DNA" Klann TS, Black J, Gersbach CA. Curr Opin Biotechnol. 2018 Feb 28;52:32-41.
  • CRISPRによるゲノム編集とエピゲノム編集およびプール型スクリーンの応用;ヌクレアーゼ活性を利した変異導入によるスクリーン;CRISPRiによるスクリーン:CRISPRaによるスクリーン;一細胞解析との組み合わせ - crisp-bio関連記事 (CRISPR関連文献メモ_2016/12/19CRISPRメモ_2018/02/05)
7.二重sgRNAs/Cas9と体細胞核移植を介して、GHRノックアウト・ラロン症候群 (Laron syndrome)モデルブタを作出
8.[レビュー] CRISPRによる診断と治療が進むと、ポイント・オブ・ケア診断 (POCD)と初期と早期治療のツールもPCR依存から脱却して新世代へ
  • "Diagnosis and therapy with CRISPR advanced CRISPR based tools for point of care diagnostics and early therapies" Uppada V, Gokara M, Rasineni GK. Gene. 2018 Feb 27.
9.遺伝子座特異的クロマチン沈降を可能としたenChIP法:標的遺伝子座をCRISPR-dCasシステムで標識
  • "enChIP systems using different CRISPR orthologues and epitope tags"Fujita T, Yuno M, Fujii H. 
    BMC Res Notes. 2018 Feb 27;11(1):154.
  • enChIPは" engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation"に由来
  • 下図はSa-dCas9によりIRF1遺伝子座の選択的分離に成功した例(Sp-dCas9での分離も報告)
 aureus CRISPR
10.Acidaminococcus sp. Cpf1 (AsCpf1)システムは、その温度依存性故にゼブラフィッシュとアフリカツメガエルで低活性である