出典
- "Real‐time observation of flexible domain movements in CRISPR–Cas9" Osuka S, Isomura K, Kajimoto S, Komori T, Nishimasu H, Shima T, Nureki O, Uemura S.EMBO J. 2018 Apr 12.；bioRxiv 2017-03-29. 東京大学プレスリリース「ゲノム編集ツールCRISPR-Cas9の動き方を解明」2018-04-17
成果概要
- 標的DNAを切断するCRISPR-Cas9のコンフォメーション変化はこれまで、一分子FRET (smFRET)や原子間力顕微鏡法でリアルタイムで観察されてきたが、東京大学の島 知弘と濡木 理らの研究チームは今回、smFRETによりCas9のRECローブ、HNHドメインおよびRuvCドメインの間のコンフォメーション変化のより精緻なモデルを提唱した (原論文Figure 6参照)。
- Cas9はsgRNA結合で安定しdsDNA非結合時には安定な静止状態(R position)にある。今回、Cas9-sgRNA複合体がdsDNAに結合・切断する段階でHNHドメインとDNAとの距離に注目することで、HNHドメインと標的DNAストランドとの距離が遠い中間位置 (I position)、HNHドメインが標的DNAストランドに最接近した切断位置 (D positon)、加えて中間位置と切断位置の間のプレ切断位置 (D* position)の３種類の位置を識別し、静止状態とプレ切断位置との間を遷移する状態、さらに、Mg2+による活性化を経た中間状態、プレ切断位置および切断位置の３状態の間を遷移する状態が存在することを、見出した。すなわち、Cas9はコンフォメーションが揺らいでいる状態でdsDNA切断に至ると結論した。
参考：一分子FRETを利用したCas9コンフォメーション解析論文など
- "The Conformational Dynamics of Cas9 Governing DNA Cleavage Are Revealed by Single-Molecule FRET" Yang M, Peng S, Sun R, Lin J, Wang N, Chen C. Cell Rep. 2018 Jan 9;22(2):372-382.
- "Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy" Chen JS, Dagdas YS, Kleinstiver BP, Welch MM, Sousa AA, Harrington LB, Sternberg SH, Joung JK, Yildiz A, Doudna JA. Nature. 2017 Oct 19;550(7676):407-410. Epub 2017 Sep 20.（crisp_bio注：極めて高精度なHypaCas9開発）
- "A conformational checkpoint between DNA binding and cleavage by CRISPR-Cas9" Dagdas YS, Chen JS, Sternberg SH, Doudna JA, Yildiz A. Sci Adv. 2017 Aug 4;3(8):eaao0027.；2017/08/07 CRISPRメモ_2017/08/07 [第1項] Cas9は、DNA結合から、gRNAとDNAの相補性をチェックするコンフォメーションを経てDNA切断に至る．
- "Conformational control of DNA target cleavage by CRISPR-Cas9" Sternberg SH, LaFrance B, Kaplan M, Doudna JA. Nature. 2015 Nov 5;527(7576):110-3. Epub 2015 Oct 28.
参考：AFMによるCas9動態観察論文紹介crisp_bio記事
- 2017/11/11 Cas9ムービー - 原子力間顕微鏡（AFM）観察
参考：一分子FRETによるCascadeの動態観察紹介crisp_bio記事
- CRISPRメモ_2017/12/29- 5 タイプI-E CRISPR-CasシステムのCascadeが標的を探索し標的に結合する動態を一分子FRETによりリアルタイムで観察
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