１．塩基エディターBE4とABEを、BE4max/AncBE4max/ABEmaxへと強化
- [出典] "Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestral reconstruction" Koblan LW, Doman JL, Wilson C, Levy JM, Tay T, Newby GA, Maianti JP, Raguram A, Liu DR. Nat Biotechnol 2018 May 29.
- 病因変異の多くを示す点変異の精密修復が塩基エディター(BE)技術によって実現した。BEは、不活性化したCas9と中立あるいは定方向分子進化させた核酸塩基デミアーゼ、および、手法によっては一塩基編集結果を保護するタンパク質とで構成される。シチジンBEのBE4とアデニンBEのABE7.10によって、ClinVarデータベース登録病原性SNPsの61%に見られるトランジション変異 (C-to-T; G-to-A; A-to-G; T-to-C)の修復が可能になった。BEはまた、植物、魚類、両生類およびヒト胚に成功裏に展開されてきた。しかし、標的サイトまたは細胞型では編集効率が著しく低いことが課題であった。
- 予備実験において効率のボトルネックは遺伝子導入ではなく遺伝子発現にあることを同定
- BE4max:BE4において核移行シグナル (NLS)をN末端とC末端ともにSV40NLSからbipartite NLSへ変更 (bis-bpNLS)することで効率を1.3倍に、続いて、コドン最適化法をIDTからGenScriptに変更することで さらに効率を1.8倍に
- AncBE4max: APOBEC1シチジンデアミナーゼの発現向上を目指して、BE4maxのrAPOBEC1を、最尤法で構築したAPOBECの進化系統樹から推定した (Ancestral sequence reconstruction)祖先アミノ酸配列Anc689 (rABOBEC1の36のアミノ酸改変に相当）に差し替えたバージョンであり、HEK293T細胞における評価で、BE4maxを僅かに凌ぐ最も高い編集効率を達成；HEK293T細胞におけるmRNAとタンパク質の発現レベルで見るとBE4の５倍 (BE4maxは４倍)
- ABEmax: BE4max開発と同様にABE7.10のSV40 NLSをbis-bpNLSに変更して効率~1.5-2倍に、コドン最適化により効率を1.3-7.9倍に。
- 患者由来繊維芽細胞などにおける点変異修復と変異導入効率向上も実証
２．[プロトコル]蛍光タンパク質のホモ接合ノックイン細胞の生成と判定
- [出典] "Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR–Cas9 genome editing" Koch B, Nijmeijer B, Kueblbeck M, Cai Y, Walther N, Ellenberg J. Nat Methods 2018 May 24.
- 一対のCas9D10Aニッカーゼを利用した相同組換え修復 (HDR)を介した特定の遺伝子座への蛍光タグの挿入法と、挿入が起きた細胞を効率的に同定する実験のプロトコル詳細；形質導入から判定まで6~9日
３．Riemerella anatipestiferのタイプⅡ-C CRISPR-Casシステムにおけるスペーサ獲得はCas1とCas2に依存する
- [出典] "Cas1 and Cas2 from the type II-C CRISPR-Cas system of Riemerella anatipestifer are required for spacer acquisition" He Y [..] Cheng AC [..] Zhang L. Front Cell Infect Microbiol 2018 May 24.
- タイプⅡ-C CRISPR-Casシステムにおいても、タイプI-EシステムとII-Aシステムと同様に、Cas1とCas2の双方がスペーサー獲得に必要なことを同定
４．CRISPRMatch：ハイスループットCRISPRゲノム編集データ解析の自動化・可視化ツール
- [出典] "CRISPRMatch: An Automatic Calculation and Visualization Tool for High-throughput CRISPR Genome-editing Data Analysis" You Q [..] Zhang Y, Zhang T. Int J Biol Sci 2018 May 22.
- CRISPR-Cas9およびCRISPR-Cpf1で編集した結果の次世代シーケンシング (NGS)データによる判定を自動化しその結果を見やすく表示するパイプラインを開発し (下図参照)、ソースコードをGitHubで公開
５．DNA, mRNAおよびCas9/sgRNA RNPの送達に利用可能な汎用グルタチオン(GSH)応答性ナノプラットフォーム
- [出典] "A Universal GSH-Responsive Nanoplatform for the Delivery of DNA, mRNA, and Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein" Chen G, Ma B, Wang Y, Gong S. ACS Appl Mater Interfaces. 2018 May 25.
- 遺伝子治療には効果的で安全な担体が必要であり未だ探索が続いている。米中の研究チームは今回、負に帯電した生体高分子を静電相互作用を介して結合し、効率的送達 (細胞内取込、エンドソームエスケープ、続いて、細胞質での積み荷放出)を実現するポリプレックス・システムを開発。
CRISP_SCIENCE@ScienceCrispA Universal GSH-Responsive Nanoplatform for the Delivery of DNA, mRNA, and Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein.
2018/05/30 12:22:50
Chen G, Ma… https://t.co/uZjr8dOITu
６．ヒツジ・ゲノムのトリオ解析から探ったCas9多重編集のオフターゲット作用
- [出典] "Low incidence of SNVs and indels in trio genomes of Cas9-mediated multiplex edited sheep" Wang X [..] Huang X, Jiang Y, Chen Y. BMC Genom. 2018 May 25.
- 多重度~25.8xのWGSトリオ解析により、ゲノム編集したヒツジの子孫における変異におけるde novo変異を同定 (下図参照)；その中でオフターゲット変異は、2.4 kbの逆位の１件だけであった。
７．[特許公開] RNP (Cas9とgRNAの複合体)の評価、選択および設計法
[出典] "EVALUATION OF CAS9 MOLECULE/GUIDE RNA MOLECULE COMPLEXES" US20180135109. PubDate: 2018-05-17. Inventors: Jayaram H, Selleck Jr.W. Assignee: EDITAS MEDICINE, INC.
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